蓝杆藻ATCC 51142中α-酮戊二酸脱羧酶的克隆与表达

α-酮戊二酸脱羧酶催化α-酮戊二酸的非氧化脱羧生成琥珀酸半醛,其在琥珀酸半醛脱氢酶的作用下转化为琥珀酸,蓝藻的三羧酸循环由于这2个酶的存在而变得完整。Blast序列分析发现,蓝杆藻ATCC 51142中cce4227基因编码α-酮戊二酸脱羧酶。为了证实cce4227基因编码蛋白的催化功能,从蓝杆藻ATCC 51142基因组中克隆cce4227基因,然后构建pET28a-cce4227表达质粒。将该质粒与p Tf16分子伴侣质粒共转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞后进行重组蛋白的诱导表达。利用镍亲和层析方法对cce4227蛋白进行分离纯化,得到纯度 95%的cce4227蛋白,菌体蛋白收率约为12 mg/g。酶动力学测试表明,cce4227蛋白是1个焦磷酸硫胺素(TPP)依赖型的α-酮戊二酸脱羧酶。