源于Halomonas sp.抗草甘膦EPSPS的克隆、鉴定及应用

为培育高抗草甘膦作物以应对草甘膦杂草进化，从海洋细菌中筛选到1株高抗草甘膦的盐单胞菌属菌株（Halomonas sp.），通过基因组测序及生物信息学分析，确定该菌株的EPSPS基因，在Escherichia coli（DE3）中对fHoEPSPS、mfHoEPSPS（G384A位点突变）和mHoEPSPS（mfHoEPSPS N端缺失PDT）进行重组表达和纯化，并运用自切割肽LP4/2A介导的基因聚合策略，将抗草铵膦的酶（Repat）置于mHoEPSPS的N端，构建了双抗草甘/铵膦酶（RLH），将其编码基因导入烟草后赋予草甘/铵膦复合抗性。结果显示，该菌株的EPSPS基因（fHoEPSPS）可编码一个N段融合了预苯酸脱水酶（PDT）的双功能酶。草甘膦抗性分析显示mfHoEPSPS的抗性比fHoEPSPS提高了19倍，将mHoEPSPS基因导入烟草后可赋予烟草3倍推荐剂量的草甘膦耐受性，转RLH基因的烟草能够耐受3~5倍推荐剂量的草甘/铵膦复合除草剂。结果表明，源于Halomonas sp.的抗草甘膦EPSPS是一种新型草甘膦耐受酶，通过G384A的位点突变可提高酶活；利用自切割肽介导的基因堆叠策略获得的转RLH基因烟草表现出较高草甘/铵膦复合抗性。