血管内皮生长因子（VEGF）实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

 应用SYBR Green荧光染料检测方法构建VEGF基因质粒标准品，能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪，提取皮肤创面总RNA，设计特异引物，进行RT PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18 T载体连接，转化宿主菌DH5α，提取重组质粒DNA，并经酶切、PCR和测序鉴定，计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品，进行实时荧光定量PCR。建立的VEGF基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好，检测灵敏度可达1.0×103拷贝，线性范围达1.0×103~1.0×108拷贝，阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982)，扩增效率高(E=96.92％)。通过构建版纳微型猪近交系VEGF基因质粒标准品，为探讨VEGF基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。