用ZBED6基因敲除猪研究心脏发育的分子机制

【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子，为了探讨 ZBED6 在心肌生长发育中的调控机制，利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪（ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪（ZBED6-WT)的心脏组织转录组，挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析，利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作石蜡组织切片对心肌进行组织学分析，比较其组织结构的差异。提取ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织的总RNA，以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。以猪Sus_scrofa10.2为参考序列，用转录组的标准流程筛选ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织中的差异表达基因，对差异基因进行GO和IPA富集分析。随机选择9个差异表达基因，利用实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】ZBED6-KO猪心脏重以及IGF2表达量均显著高于ZBED6-WT猪（P＜0.05），与ZBED6-WT猪相比，ZBED6-KO猪肌纤维的宽度较宽，结缔组织较少，ZBED6基因的敲除对家猪心脏的生长发育有一定的促进作用；测序结果显示，各样本获得至少10 G的数据量，每个样本clean ratio、Q30 data均达到90%以上，其中62.8%-80.1%的reads能比对到猪的基因组上，表明测序饱和度良好，测序数据真实可靠；对测序数据进行分析，筛选到 184个差异基因，其中上调的基因114个，下调的基因70个，注释的141个，未注释的43个；差异基因层次聚类分析显示，ZBED6-KO组（x1、x3、x6）的3个个体表达模式相似，ZBED6-WT组（x2、x4、x5）的3个个体表达模式相似；GO和IPA富集分析得到13个显著的GO条目，33条显著的pathway通路，差异基因主要富集在免疫反应、肌肉发育和RhoA信号等相关的通路；qRT-PCR 检测9个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致，证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】首次以ZBED6-KO巴马小型猪为模型，利用RNA-Seq技术探究了ZBED6敲除对心脏发育和功能的影响，丰富了ZBED6 对心脏发育和功能的研究。

Studying the Molecular Mechanism of Heart Development by Using ZBED6 Gene Knockout Pig