烟草NbbZIP28突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

【目的】bZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERs）因子NbbZIP28；NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升，本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株，以野生型植株为对照，分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液，检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化，接种CMV后0-48 h，采用qRT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR)基因的表达。本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后，在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP，瞬时表达48 h后，采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活；采用在线搜索工具PlantCARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件。【结果】CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后，目的基因靶位点缺失了10个碱基，导致翻译错误、蛋白功能变化。在正常生长条件下，转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异。植株接种TMV-GFP后4-8 d，突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型，扩展至新叶的速度较快。接种CMV后12-48 h，突变体中UPR相关基因BiP、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型；5-7 d突变体中的病毒外壳蛋白（coat protein，CP）基因表达量显著高于野生型，花叶及皱缩症状更显著。蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥AtbZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点。Western blot检测发现，与接种清水对照相比，TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解。NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件（heat stress response element，HSE）、3个参与低温反应的顺式作用元件（low temperature response element，LTR）、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件（TC-rich repeats）。【结论】病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因；NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升，病毒诱导的UPR基因表达被抑制。NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子，在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖。

Targeted Mutagenesis of NbbZIP28 and Its Stress Response to Virus Infection in Nicotiana benthamiana