枯草芽孢杆菌菌株BAB-1表面活性素的分离纯化及性质分析

 枯草芽孢杆菌菌株BAB-1对番茄灰霉病菌有较强的抑制作用,为了明确其抑菌活性相关成分,通过盐酸沉淀、甲醇抽提法,从该菌株发酵上清液中分离得到了一种脂肽类化合物。经HPLC分析纯化后,发现其保留时间与表面活性素标准品基本一致。TLC层析结果表明该菌株能够产生与表面活性素标准品Rf值一致的成分。进一步通过电喷雾质谱分析,得到其[M+H]+值分别为m/z 1 009.3、1 023.4、1 037.4的成分,与已知的表面活性素3种同系物的[M+H]+值一致。最后采用PCR扩增特异性片段sfp的方法证实该菌株有产生表面活性素的同源基因。综合分析表明,枯草芽孢杆菌菌株BAB-1能够产生表面活性素,且提纯后的表面活性素具有明显的溶血和排油活性,并通过显微观察确定了其十字晶体状结构。     

枯草芽孢杆菌OKB105产生的surfactin防治烟草花叶病毒病及其机理研究

本文研究枯草芽孢杆菌产生的脂肽化合物表面活性素surfactin对烟草花叶病毒病的防治效果,并检测烟草防卫相关基因的表达情况以解析抗病机理。利用6 mol/LHCl沉淀枯草芽孢杆菌OKB105的去细胞培养液,通过甲醇抽提,Sephadex LH20层析柱获得脂肽纯化物。经MALDI-TOF-MS和血平板溶血试验检测表明,纯化物中仅含有表面活性素surfactin。将表面活性素配成0.01 g/L溶液,处理烟草并接种TMV。结果表明, surfactin对烟草花叶病毒病有显著的防治效果,病斑抑制率为70.9%。通过Real-time PCR检测烟草的防卫相关基因的表达情况结果发现,烟草SA信号通路的PR1、PR3和PR5,以及ET通路的ETR1表达量显著提高,说明surfactin诱导了烟草依赖于SA和ET信号通路的诱导系统抗性（induced systemic resistance, ISR）反应。     

枯草芽孢杆菌G3菌株的抗菌物质及其特性

 产几丁质酶枯草芽孢杆菌G3菌株的固体培养物在黄瓜灰霉病菌和番茄叶霉病菌抑菌试验中证实,抑菌活性物质存在于过滤上清液中,它们是从酸沉淀物中提取出的伊枯草菌素、生物表面活性素和存在于盐析粗蛋白中的几丁质酶。在叶霉孢子萌发试验中,伊枯草菌素微弱地抑制孢子萌发但强烈破坏芽管和新生菌丝;生物表面活性素和几丁质酶则强烈抑制孢子萌发并长久性地抑制芽管伸长。在PDA平板上的灰霉菌丝抑菌试验中,伊枯草菌素抑制菌丝生长,引发菌丝顶端膨大,形成泡囊,泡囊破裂后原生质外泄;几丁质酶抑制菌丝生长,引发产生不规则的菌丝团;生物表面活性素在平皿上对菌丝则不显示出抑菌活性。     

表面活性素促进枯草芽胞杆菌XF-1在大白菜叶际定殖能力研究

枯草芽胞杆菌XF-1是一株大白菜内生生防菌,通过叶面喷施的方式可有效防控大白菜根肿病,但其叶际定殖的分子机制尚不明确。为了明确表面活性素对XF-1在大白菜叶际定殖的影响,进一步提高其在田间应用效果,本研究通过测定生长曲线、泳动运动、群集运动和24孔细胞培养板静置培养试验,分析表面活性素对XF-1菌株生长速率、运动能力和生物膜形成水平的影响;利用叶片-微生物互作分析和定殖试验,测定XF-1及突变体XF-1-ΔsrfA在大白菜叶表黏附和植株内的定殖能力。结果表明,XF-1-ΔsrfA与XF-1相比生长曲线没有明显差异,泳动能力和群集运动能力分别显著下降了36.8%和43.9%,静置培养24 h后生物膜形成能力显著下降53.9%,48 h后无显著差异。叶片-微生物互作试验中,突变体标记菌XF-1-ΔsrfA-gfp黏附效率较XF-1-gfp约下降80%。喷施接种3~7 d后, XF-1-ΔsrfA-gfp相较于XF-1-gfp在大白菜叶片内和根系中的定殖数量均显著下降。试验结果表明表面活性素对枯草芽胞杆菌XF-1在大白菜叶际定殖具有较为明显的促进作用,srfA基因的缺失显著抑制XF-1的叶际定殖能力。     

枯草芽孢杆菌B006产surfactin突变株特性及其对黄瓜枯萎病的抑制能力

为了明确surfactin产量不同的芽孢杆菌对黄瓜枯萎病的控制作用,本研究采用N＋注入诱变共获得1250株芽孢杆菌B006的突变株,通过对黄单孢杆菌的抑菌试验筛选并获得3株产surfactin突变株B841、B73和B1020。对各突变株NB发酵液的HPLC—ESI—MS分析表明：突变株B841和B73的surfactin含量比野生菌株B006分别升高了15．9％和14．8％,而突变株B1020的surfactin含量比野生菌株降低了85．2％;各突变株fengycin产量未发生改变。对surfactin各组分的质谱图解析,发现突变株B841和B1020的surfactin组分发生变化,突变株B841的surfactin组分中无m／z为995的同系物,而突变株B1020的MS图谱中只发现了m／z为1037和1051的surfactin同系物;对突变株的生物学特性测定表明：突变株B73和B1020的菌落形态发生改变,生长周期缩短;3个突变株比野生菌株产芽孢能力下降,突变株B1020在含有玉米粉和豆饼粉的培养基上不产生芽孢。对各菌株添加到育苗基质中（浓度为10^6cfu·g-1）后,防治黄瓜枯萎病的效果测定表明：2周时,突变株B1020防效接近于野生菌株B006,达70％以上;但3周时,防效下降到36．2％;突变株B841防效始终低于野生菌株B006,只有29．1％。本研究发现芽孢杆菌B006及其突变株在NA培养液中的surfactin产量的高低与其在育苗基质中的防病效果无直接的相关性,对其在自然土中的防病效果值得进一步研究。     

生防菌Bs-916及高效突变菌株抗菌物质及其对水稻抗性诱导作用的研究

 枯草芽孢杆菌Bs-916是一种有效防治水稻病害的生防菌,为进一步提高其拮抗性能,获得更好的生防效果,运用离子注入(N+)的方法对Bs-916进行诱变,筛选到4株拮抗性能比出发菌Bs-916提高15%以上的菌株。TLC和HPLC定性、定量分析比较结果表明,Bs-916及其突变体分泌的脂肽类抗生素是表面活性素,突变菌株分泌的表面活性素比出发菌株有不同程度提高。室内抑菌结果表明,表面活性素能抑制纹枯病菌菌丝生长,引起原生质泄露。通过检测接种纹枯病菌、拮抗菌Bs-916及其突变菌株的水稻植株体内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的变化,发现拮抗菌Bs-916及其突变菌株分泌活性物质对水稻具有诱导抗性作用;4个高效突变株比出发菌Bs-916对3种酶的活性影响加大;同时接种拮抗菌和纹枯病菌比单独接种拮抗菌、纹枯病菌对3种酶活性影响大。     

产抗大肠杆菌脂肽化合物枯草芽孢杆菌筛选及脂肽化合物的分离纯化

采用致病性大肠杆菌作为主要指示菌,运用杯碟法对不同分离株的枯草芽孢杆菌代谢产物进行抑菌效果筛选。在确定GD株作为抗菌物质研究的基础上,采用GD株发酵液,经大孔吸附树脂XD吸附、洗脱,将获取的抗菌产物样品与表面活性素标准品进行薄层色谱(TLC)层析、分析、比较。运用液质联用(LC-MS)分析技术对代谢产物样品中各组分的含量、分子量及结构进行分析。结果显示:GD株在发酵过程中产生的抗菌物质是以表面活性素A、B和C等同系物为主组成的脂肽混合物。表面活性剂含量达77.39%,分子量主要分布在1 036.6933~994.6449之间。     

枯草芽孢杆菌SN-02抑菌物质的分离、纯化及结构测定

为明确生防菌株Bacillus subtilis SN-02产生的抑茵物质的种类和组成,对其进行分离、纯化及结构测定.发酵滤液经盐酸沉淀,有机溶剂提取,薄层层析显色分析,初步确定该活性物质是一种具有闭合肽键的脂肽类物质.经Pharmadex LH-20精制后得到纯度为95.7%的淡黄色结晶状物质,液质联用检测到活性成分是分子量为1080、1035和1021 D的生物表面活性素.紫外吸收光谱表明该物质在210nm处有吸收峰,红外吸收光谱证实该分子的亲水基是一条肽链,疏水基部分是一脂肪酸分子,且为一种环状脂肽类物质.氨基酸分析表明该活性物质由4种氨基酸组成,且4种氨基酸的摩尔比为Glu∶Leu∶Val∶Asp=1∶4∶1∶1.     

菌根真菌协同死谷芽孢杆菌抑制棉花黄萎病

利用温室盆钵实验,双接种丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)地表球囊霉(Glomus versiforme)和死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis, HJ-5),研究AMF协同HJ-5控制棉花黄萎病的效果,并通过液相色谱法、馏分平板对峙法探析协同抗病的原因。结果表明:与对照相比,AMF和HJ-5在控制棉花黄萎病方面具有协同增效的作用,发病率下降50.82%,地下部干重增加125.00%,根际HJ-5数量增加23.80%。液相色谱分析表明,HJ-5分泌伊枯草菌素(iturin A)和表面活性素(surfactin)2种抗病性脂肽类物质。双接种AMF、HJ-5,棉花根际伊枯草菌素和表面活性素含量分别比HJ-5单处理增加13.38%和11.27%。接种AMF促进了植株地下部生长和HJ-5在棉花根际的定殖,并分泌更多的抗病类物质,是AMF与HJ-5协同抗棉花枯萎病的重要机理。     

饲料中胆固醇和卵磷脂水平及添加表面活性素对凡纳滨对虾蜕壳间期的影响

通过2组试验分别研究饲料中胆固醇和卵磷脂水平对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)蜕壳间期及添加表面活性素对凡纳滨对虾蜕壳间期和肝胰脏抗氧化能力的影响。试验一:将100尾均重为(0.61±0.02)g的凡纳滨对虾随机分为10组(每组10个重复,每个重复1尾虾),即饲喂基础饲料的对照组以及饲喂分别添加0.2%、0.4%和0.6%胆固醇与1.0%、2.0%和3.0%卵磷脂的试验饲料的9个试验组,试验期为35 d,研究饲料中胆固醇和卵磷脂水平对凡纳滨对虾蜕壳间期的影响。试验二:将90尾均重为(0.48±0.03)g的凡纳滨对虾随机分为6组(每组15个重复,每个重复1尾虾),对照组饲喂试验一中胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%的试验饲料,5个表面活性素添加组分别饲喂在对照组饲料基础上添加10、20、40、80和160 mg/kg表面活性素的试验饲料,研究饲料中添加表面活性素对凡纳滨对虾蜕壳间期及肝胰腺抗氧化能力的影响,试验期为28 d。结果表明:饲料中胆固醇水平显著影响凡纳滨对虾蜕壳间期(P0.05),卵磷脂水平对蜕壳间期的影响不显著(P0.05);饲料中胆固醇和卵磷脂水平对蜕壳间期的影响存在显著的交互作用(P0.05)。胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和1.0%组、胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%组以及胆固醇和卵磷脂水平分别为0.6%和2.0%组的蜕壳间期显著短于其他组(P0.05),其中胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%组蜕壳间期最短。与对照组相比,仅10 mg/kg表面活性素添加组凡纳滨对虾蜕壳间期显著缩短(P0.05),肝胰腺总抗氧化能力显著提高(P0.05);各表面活性素添加组的肝胰腺超氧化物歧化酶活性均较对照组显著上升(P0.05);与对照组相比,10和20 mg/kg表面活性素添加组的肝胰腺过氧化氢酶活性升高(P0.05),其他表面活性素添加组则显著降低(P0.05);除10 mg/kg表面活性素添加组外,各表面活性素添加组的肝胰腺谷胱甘肽过氧化物酶活性均较对照组显著上升(P0.05);仅10和20 mg/kg表面活性素添加组的肝胰腺丙二醛水平较对照组显著降低(P0.05)。由此得出,本试验条件下,饲料中胆固醇水平及其与卵磷脂水平的交互作用显著影响凡纳滨对虾蜕壳间期,胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%时蜕壳间期最短;在胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%的饲料中添加10 mg/kg表面活性素可缩短凡纳滨对虾的蜕壳间期,提高肝胰腺抗氧化能力。