大白菜软腐病菌游动性突变体在大白菜体内增殖扩展研究

 用培养皿滤纸吸附测定法和不伤根土壤拌菌处理及针刺接种法,测定了大白菜软腐病菌游动性突变体进入大白菜体内、并在其中侵染定殖和扩展的特性。结果表明,游动性丧失和增强的突变体都可以通过种子萌发和主动接触进入大白菜体内、并可以在体内有短期的繁殖,但菌量远低于野生菌。大白菜叶片接种实验说明,这两种突变体也都可以进行短距离扩展,但扩展距离和菌的繁殖量低于野生菌。     

苹果紧凑型品种和矮化砧木内源激素的变化

 以不同矮化程度的苹果品种、砧木和嫁接植株为试材, 研究了春梢旺长期茎尖和春梢停长期叶片的内源激素变化。结果表明, 与普通型品种相比, 紧凑型品种茎尖和叶片中的赤霉素(GA₁₊₃) 含量显著降低而细胞分裂素(CTKs) 含量显著升高, 紧凑型品种的CTKs/ GA₁₊₃约是普通型品种的4. 78～6. 24 倍。不同矮化程度的砧木间相比, 春梢停长期叶片中, M9 的IAA 含量比平邑甜茶降低了53. 7 %。以M26作中间砧, 显著降低了接穗叶片和基砧新根中的IAA 含量; 但以新红星作中间砧则影响较小。将M26中间砧与紧凑型品种组合, 与乔砧普通型植株相比, 春梢停长期叶片和新根中IAA 含量分别下降了46. 1 %和33. 3 %,CTKs/ GA₁₊₃是其2. 8～3. 6 倍, 其变化幅度大于单一应用矮化砧、紧凑型品种的植株。因此, 紧凑型、矮化砧具有不同的激素调节机制, GA、CTK在紧凑型品种矮化中起重要作用, 而矮砧的矮化可能与IAA 密切相关。     

基于pGhost4系统保加利亚乳杆菌乙酸激酶敲除载体的构建

保加利亚乳杆菌凭借其微生物特性和效能优异等特点成为当下产乳酸最重要的微生物菌株之一。乙酸是保加利亚乳杆菌代谢乳酸最主要的副产物,它的大量生成降低葡萄糖的代谢利用率,并且消耗了能量。乙酸激酶是控制乙酸生成的关键酶,敲除乙酸激酶基因,理论上可以阻断戊糖磷酸途径中乙酸的生成,从而优化代谢途径提高葡萄糖代谢乳酸的利用率。研究以Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 11842公布的乙酸激酶基因ack序列设计引物,以保加利亚乳杆菌基因组DNA为模板,PCR克隆出ack上下游片段,利用重叠PCR技术将上下游片段拼接在一起,并连入具有温敏性的p Ghost4载体。     

番木瓜环斑病毒弱毒株的构建及分析

弱毒株是利用交叉保护防治植物病毒病害的关键限制因子。通过对马铃薯Y病毒属病毒(强、弱毒株)的全长及部分氨基酸序列比对分析,筛选出在亲本强毒株PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个可能与致病性相关的氨基酸突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))。采用定点突变和Gibson拼接法,分别成功构建了4种含有2个突变位点(L_(754)和N_(787))、4个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)和D_(944))、6个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))和8个突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))的PRSV-LM全长c DNA侵染性克隆突变体:p Gprsvm~2、p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8。经人工接种、病症观察和RT-PCR检测,4种突变体克隆均能系统性侵染非转基因番木瓜植株,除克隆p Gprsvm~2的病症表现与亲本强毒株PRSV-LM一致外,其他多位点突变的克隆p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8在番木瓜植株上的病症严重程度出现依次减弱,而克隆p Gprsvm8的病症最弱,且延迟2周发病。本实验初步验证了6个氨基酸突变位点(I_(309)→S、K_(481)→Q、K_(598)→E、F_(753)→L、R_(728)→I和D_(944)→N)与PRSV-LM的病症表现及致病力相关,其中K_(598)→E和R_(728)→I可能是影响致病性的关键位点。     

利用CRISPR/Cas9系统编辑日本结缕草ZjSGR基因技术研究

日本结缕草(Zoysia japonica)是一种常见的具有众多优良性状的暖季型草种,秋冬季节在我国北方地区会较早出现叶片脱绿现象,在一定程度上限制了日本结缕草在北方的大面积使用。ZjSGR是从结缕草中分离出来的一种衰老诱导基因,负调控叶片滞绿性状。本研究利用CRISPR/Cas9系统,通过基因枪介导的遗传转化方法实现对日本结缕草ZjSGR基因的编辑,经测序验证获得1株单碱基缺失突变植株。突变植株叶片深绿,在正常生长温度(28~30℃)条件下,和对照相比,叶绿素含量更高(P<0.05)。本研究为进一步阐述ZjSGR基因在日本结缕草滞绿性状调控中的作用机理提供了基础研究材料,也为培育日本结缕草滞绿品种育种工作奠定了基础。     

禾谷镰孢菌FGSG＿09482基因功能初探

为研究禾谷镰孢菌FGSG09482基因的生物学功能,以禾谷镰孢菌为试材,采用Split-Marker基因敲除技术构建基因敲除盒,PEG (聚乙二醇)介导转化法转化禾谷镰孢菌原生质体,在含有潮霉素的培养基上培养筛选,获得FGSG09482基因敲除突变株。通过观察比较其敲除突变体表型,从而分析鉴定该基因的生物学功能。结果表明:以野生型PH-1作为对照,敲除突变体的菌落形态没有明显变化,分生孢子形态没有明显差异,培养滤液颜色没有明显区别。分生孢子侵染番茄果实实验表明,以番茄果实为侵染宿主,对比野生型PH-1,突变体致病力没有减弱。但突变体菌落的生长速率滞后于野生型PH-1;敲除突变体的产孢量低于野生型PH-1;有性杂交实验表明,敲除突变体几乎不产生子囊壳,野生型PH-1可以。本研究初步表明,FGSG09482基因对禾谷镰孢菌菌落的生长速率有一定的调控作用;对禾谷镰孢菌的分生孢子的产量、子囊壳的产生也有影响,推测FGSG09482基因可能与禾谷镰孢菌有性生殖、无性生殖过程相关。     

花生EMS诱变体系的探索及突变体鉴定

突变体创制对花生遗传改良和功能基因组学研究具有重要意义。为获得最佳诱变效果,本研究对不同基因型花生品种的EMS诱变条件进行摸索,发现花育22号、花育71、花育9301、狮头企和伏花生的最适诱变浓度分别为0.4%、0.5%、0.3%、0.5%和0.3%。通过对最适EMS浓度诱变处理下苗期芽长、株高、根长及根数目分析,发现5个品种虽然都能正常成苗,但均受到较严重的损伤。在预实验基础上,用浓度为0.4%的EMS溶液处理了大约5000粒花育22号种子,M1及M2世代性状调查显示突变群体表型丰富,出现株高、株型、荚果、籽仁、分枝数、叶形等表型变异株系,表型变异率为12.9%。本研究为花生遗传改良和功能基因组学研究提供了丰富的种质材料。     

抗春雷霉素大豆根瘤菌突变株的诱变及其生物固氮特性的分析

根瘤菌与豆科植物共生可以固定大量的氮。根瘤菌剂接种豆科作物是一项普遍推广应用、有效的农业技术。但由于大量土著根瘤菌的存在，产生竞争障碍，降低了接种菌剂的占瘤率。大多数的土著根瘤菌对春雷霉素敏感，因此接种抗春雷霉素的高效结瘤固氮根瘤菌，并用春雷霉素处理种子，可抑制土著根瘤菌，提高接种菌剂的占瘤率，从而达到高结瘤、高固氮和提高产量的目的。本文将探讨诱变对根瘤菌抗春雷霉素突变的作用，并对获得的抗性突变株的生物固氮特性进行分析。     

具有中国大豆遗传背景的7S与11S多亚基缺失型大豆新品系的创制

利用我国高油大豆品种东农47与日本引进多亚基缺失型育种材料日B,采用回交、三交的育种方法,综合系谱选择,通过SDS-PAGE技术分析亚基组成,在BC₁、BC₃及三交种F₈群体内,选育到(α+11S groupⅡa)-缺失型、(α′+11S groupⅡa)-缺失型、[(α′+α)+11S groupⅡa、Ⅱb]-缺失型、[(α′+α)+11S groupⅡa]-缺失型、[(α′+α)+11S groupⅡb+X₁X₂]-缺失型、[(α′+α)+11S groupⅡb]-缺失型和(α′+11S groupⅠ、Ⅱa)-缺失型共7种具有中国大豆遗传背景的7S球蛋白α′、α亚基与11S球蛋白groupⅠ(A_1aB_1b,A₂B_1a,A_1bB₂)、groupⅡa(A₄A₅B₃)和groupⅡb(A₃B₄)不同亚基缺失组合新种质。测定优良品系的综合农艺性状及氨基酸组成、含量,结果表明,与对照相比,各种缺失突变体的各种氨基酸组分含量普遍提高,蛋白总量普遍高于轮回亲本,精氨酸含量特别是游离精氨酸的含量大幅提高。其中亚基组成为(α+11S groupⅡa)-缺失型品系G2-2-3的17种氨基酸含量、氨基酸总量、蛋氨酸含量均显著高于轮回亲本东农47,特别是游离精氨酸含量高出7.27mg/g。以上结果表明,7S与11S多亚基缺失型优良品系在有效去除致敏蛋白的同时,可以提高大豆蛋白氨基酸含量, 改善大豆蛋白氨基酸组分配比。各种致敏蛋白缺失型大豆优良新品系的获得,大大丰富了我国蛋白质组分改良育种的种质基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

目的 将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。方法 分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1 μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3 μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。结果 建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLV-sgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。结论 利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。