Cloning and Expression of Bile Salt Hydrolase Gene from Lactobacillus plantarum M1-UVS29

We cloned and expressed bile salt hydrolase gene of Lactobacillus plantarum M1-UVS29 in Lactococcus lactis NZ9000 successfully. Gene-specific primers for amplification of L. plantarum bsh were designed by using sequence which availabled from Gen Bank. The production of PCR amplicon was confirmed by sequencing and cloned into pMD18-T vector, and then recombined into expression vector p NZ8148 and yielding vector p NZ8148-BSH. p NZ8148-BSH was transferred into Lactococcus lactis NZ9000. Sequencing indicated that the cloned bsh fragment contained 995 nucleotides, and shared 99.3% sequence homology with bsh gene from L. plantarum MBUL10. Cloned bsh fragment was successfully transduced into NICE expression system and confirmed by PCR and restriction digest. Recombinant BSH protein was analyzed by SDS-PAGE. The molecular weight of BSH protein was approximately 37 ku. Activity of the expressed protein was 0.77 μmol · min-1. The successfully expressed proteins by genetic engineering technology made the function of lactic acid bacteria be abundant and laid the foundation for further researches into cholesterol-lowering lactic acid bacterium food and probiotics.     

喀斯特地区泡核桃林土壤酶、微生物量及无机氮的动态研究

【目的】泡核桃林的土壤质地是决定核桃产量的重要因素。开展喀斯特地区泡核桃林土壤肥力状况及微生物群体功能年际变化的研究,不仅有助于指导泡核桃科学高效地生产,而且能为该地区的石漠化治理、土地修复实践提供理论基础。【方法】对喀斯特地区不同种植年限（4、5、6、7 年）泡核桃林土壤酶活性、微生物生物量（碳、氮）及无机氮（硝态氮、铵态氮）的变化及其相关性进行测定和分析。【结果】（1）泡核桃种植 5、6 年后,土壤酶活性普遍高于种植 4、7 年。（2）随着种植年限的增加,微生物量碳呈先增后降的趋势,而微生物量氮逐渐增加,且种植 5、6、7 年后差异不显著;泡核桃种植 4 年后的微生物量碳氮含量均极显著低于其他年限。（3）随着种植年限的增加,铵态氮含量呈波动式变化,硝态氮先增后减,且种植 6 年后的硝态氮含量极显著高于其他年限处理。（4）酶活性、微生物量和无机氮含量均随着土层深度（0~10、10~20、20~30 cm）的增加而降低,显示出明显的“表聚现象”。（5）酶活性、微生物量和无机氮含量三者之间具有不同程度的相关性。【结论】总体来看,泡核桃林的建立有利于喀斯特地区的土壤发育。在泡核桃种植 7 年后,应注重水肥管理以提升泡核桃果实的质量,同时为该区的生态恢复提供基础条件。     

温度对麦秸混合物料厌氧干发酵中糖类水解酶活性的影响

水解酶活性直接影响到秸秆厌氧干发酵的沼气产量。本文以麦秸为主要原料, 配制干物质含量(TS)35%的混合发酵物料, 设置20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃ 5种不同温度条件, 发酵周期为35 d, 测定发酵过程中料液的纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和蔗糖酶的活性变化。结果表明, 沼气产气高峰在35 ℃左右, 20~40 ℃时, 随着温度的升高, 发酵后料液的料液干物质含量(TS)、可挥发固体含量(VS)、C/N均明显下降, 发酵产沼气后, 各处理发酵液 pH都降到7.0以下, 其中40 ℃的pH降低幅度最大。纤维素酶活性在发酵初期较低, 峰值出现也较晚, 温度升高明显有利于提高纤维素酶活性。木聚糖酶的起始活性较高, 整个发酵过程中呈先升高后降低并渐趋于平缓的变化趋势, 20~25 ℃处理的木聚糖酶活性在整个发酵过程中没有明显峰值。淀粉酶的起始活性较低, 但随后迅速升高, 30~40 ℃处理在10 d左右达到峰值后开始下降, 此后酶活力的变化幅度较前期平稳。蔗糖酶的起始酶活力较低, 随后升高迅速, 温度在30 ℃以上时酶活性增加更快, 35 ℃时15 d达到峰值后迅速下降, 下降速度明显大于30 ℃和40 ℃处理。由此可见, 温度对秸秆厌氧干发酵过程中不同水解酶活性的影响还是有所差异的。     

猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析

从人泛素C端水解酶L1(UCH_L1)基因出发,在dbEST数据库中同源搜索,找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST(BM194679).通过电子克隆和进一步RT-PCR试验验证,获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列,其全长 1 105 bp,开放阅读框(ORF)位于60～728 bp,编码223个氨基酸.同源性分析结果表明,与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为91.2%和86.5%,蛋白质序列同源性均为96.6%.对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域,不含有信号肽,存在1个UCH_L1(pfam01088)保守结构域和多个磷酸化位点,属UCH_L1蛋白家族,故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因(登录号AY495532).     

细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacterium sp.)的有机磷水解酶基因(opd 构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体Pymbp,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd.SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质.重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100 μmol/L Go2 培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg.用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%.重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活.     

有机磷水解酶及其细胞表面展示研究进展

对有机磷水解酶在酶学特性、蛋白结构和细胞表面展示等方面的研究进行了综述,并且对该领域的研究趋势进行了展望。     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

圆叶决明添加量对红壤可溶性氮及酶活性的影响

为了探明圆叶决明(Chamaecrista rotundifolia)降解后红壤可溶性氮及氮水解酶活性的变化规律,本研究采用室内好气恒湿培养法,研究占红壤质量0.5%(T1),1%(T2)和2%(T3)的圆叶决明添加至红壤中,培养7~88d内红壤硝态氮(NO^-₃-N)、铵态氮(NH⁺₄-N)和可溶性有机氮(Soluble organic nitrogen,SON)及脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶的变化。结果表明：添加圆叶决明后,红壤NO^-₃-N和NH⁺₄-N含量在培养前期降低,培养中期增加;而整个培养期SON含量及脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶活性均增加,且圆叶决明添加量越大,效果越显著。NO^-₃-N和SON含量及脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶活性可用2次或3次函数方程拟合;而NH⁺₄-N含量可用线性函数拟合。氮水解酶与NO^-₃-N负相关,与NH⁺₄-N和SON正相关,且相关性从大到小的顺序为蛋白酶>天冬酰胺酶>脲酶。综上,添加圆叶决明提高了红壤供氮水平和红壤氮转化能力。     

家蚕消化液对几种外源性酶活性的影响

通过体外试验和经口添食试验表明,家蚕消化液对纤维素酶和果胶酶具有明显的 抑制作用.分析认为,这是由于消化液的强碱性或消化液中存在的蛋白酶的分解作用 所致.因此,利用外源性消化酶的可能途径是先经酶促反应,将大量纤维素或果胶等 转变成可吸收利用的还原糖形态,然后进行给饵.     

Enzyme activity and microbial biomass in a field soil amended with municipal refuse

Summary Changes in enzyme activity levels, in biomass-C content, and in the rate of fluorescein diacetate hydrolysis were measured in a loamy soil to which solid municipal refuse had been applied as compost over a 3-year period at two different rates. Addition of the compost caused significant increases in the activity of all enzymes tested. The increases were much higher at 90 t ha^-1 year^-1 than at 30 t ha^-1 year^-1. Significant increases were also observed in the biomass-C content and in the rate of fluorescein diacetate hydrolysis. Significant correlations among changes in biomass-C content and the rate of fluorescein diacetate hydrolysis and the changes in all enzymes tested were found.Two activity indices were calculated; a biological index of fertility and an enzyme activity number. No correlations were found between the biological index of fertility and the changes in the various enzyme activities. However, significant correlations were found either between enzyme activity number and most of the changes in enzyme activity, or between the enzyme activity number index and the biomass-C content (r=0.850). The use of a new activity index, the hydrolysis coefficient, is proposed. This coefficient was significantly correlated with biomass-C content (r=0.925) and with the enzyme activity number index (r=0.780).