加州鲈弹状病毒三水株全基因组序列测定及分析

【目的】对加州鲈弹状病毒弱毒三水株(MSRV-SS-7)及其母源株(MSRV-SS)进行全基因组克隆和测序分析。【方法】采用分段扩增方法对MSRV-SS-7及MSRV-SS基因组核心序列进行PCR扩增,第1轮根据鳜鱼弹状病毒(SCRV)基因序列(NC_008514.1)设计10对引物进行扩增并测序;在第1轮扩增产物测序、拼接基础上,设计8对引物进行第2轮扩增,拼接后获得基因组核心序列。同时用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得3′和5′末端序列。采用Vector NTI 8.0对基因组核心序列和末端序列进行拼接,获得基因组全序列,使用Clone Manager 8.0对MSRV-SS-7和MSRV-SS进行序列比对分析;同时使用DNAMAN将基因组G基因序列转换为氨基酸序列,并通过MEGA 5.0与其他鱼类弹状病毒的G蛋白氨基酸序列进行进化树分析。【结果】MSRV-SS-7及其母源株MSRV-SS基因组全长均为11 548 bp,包含N、P、M、G、L等5个结构基因,基因组结构为3′Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5′;MSRV-SS-7与MSRV-SS全基因组中共有10处核苷酸不同。G蛋白进化分析表明,MSRV-SS-7及母源株MSRV-SS与SCRV亲缘关系最近,且与鲈鱼弹状病毒属(Perhabdovirus)聚为一支。【结论】克隆分析了MSRV-SS-7的全基因组序列,可以用于后续活疫苗的开发。     

青枯无致病力菌株诱导番茄抗青枯病的生化机制

用紫外诱变法获得的青枯无致病力菌株诱导番茄,植株产生了对青枯病的抗性反应,该菌株对致病菌没有直接的抑制作用,且对番茄不能致病.番茄经无致病力菌株处理后,体内与抗病反应相关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性显著增强;酚类物质和木质素含量也显著提高;病程相关蛋白(PRP)含量也提高.这表明青枯无致病力菌株产生诱导抗性的机制可能是植物本身的抗病代谢过程被激活了.     

湖南省稻瘟病菌无毒基因鉴定

【目的】了解湖南省稻瘟病菌无毒基因组成,为培育水稻新品种及合理布局抗稻瘟病品种提供参考依据。【方法】采用2014年分离自湖南桃江病圃丽江新团黑谷(LTH)上的120个稻瘟病菌单孢菌株室内离体针刺接种于24个已知抗瘟基因的水稻近等基因系(NILs)上,对供试菌株进行无毒基因鉴定。【结果】120个稻瘟病菌含有全部24个无毒基因,在24个无毒基因中,出现频率高于40.00%的有Avr-Pita和Avr-Pish;出现频率在30.00%~40.00%的无毒基因有Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9;其余无毒基因出现频率均较低,特别是Avr-Piks、Avr-Pikp、Avr-Pib、Avr-Pi12和Avr-Pi11出现频率均低于10.00%。【结论】含抗性基因Pi-ta和Pi-sh的水稻品种可在湖南省推广利用;含抗性基因Pi-z、Pi-z5、 Pi-3和Pi-9的水稻品种在湖南推广时应慎重考虑;含抗性基因Pi-ks、Pi-kp、Pi-b、Pi-12和Pi-11的水稻品种不宜在湖南省推广利用。     

转无毒基因马铃薯抗晚疫病的研究

晚疫病菌(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是危害全球马铃薯生产的严重病害.通过基因工程方法把外源基因导入植物体内以增强抗病性被证明是一条行之有效的途径.应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组合成嵌合基因构建到植物表达载体中.通过农杆菌或基因枪的介导转化植物,可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基因植株.本研究从病原细菌Pseudomonas syringae PV.tomato中获得的无毒基因avrD(0*93kb)和从病原真菌Phytophthora parasitica中获得的无毒基因Elicitin(0.294kb)分别与非专一性病原物诱导启动子Pill和BG组成含2个嵌合基因(Pill-avrD,BG-Elicitin)的植物表达载体pYH144和pYHEt.通过农杆菌LBA4404介导转化马铃薯,其中用pYH144载体转化2个品种(克新1号,2号),用pYHEt载体转化3个品种(Desiree,克新2号,4号),通过组织培养分别获得潮霉素(HygromycinB)标记的转基因马铃薯试管苗.将转基因试管苗扩繁,应用马铃薯脱毒微型种薯生产技术获得转无毒基因微型薯,在温室(15～25℃和湿度高)条件下,观察转无毒基因马铃薯植株中对晚疫病菌自然感染的抗性.1998年和1999年(每年的3-5月)的温室试验初步表明用avrD和elicitin基因分别转化的转无毒基因马铃薯植株都具有较明显的对晚疫病菌侵染的抗性,大部分转基因植株不表现或表现轻微的感病症状,对照植株(未转化)则表现明显的感病症状.转基因植株生长正常,且在感染后期(恢复期)生长良好.对照植株在恢复期生长弱和缓慢.在获得较多数量的转无毒基因马铃薯微型种薯的时候,将进行人工接种晚疫病菌和田间种植试验,从中筛选出抗真菌病和细菌病的转基因马铃薯株系.     

Identification of two new genes conferring resistance to rice blast in the Chinese native cultivar 'Maowangu'

The Chinese native rice cultivar ‘Maowangu’ expresses a high level of resistance to many races of rice blast (Pyricularia grisea) collected from North China and Japan. ‘Maowangu’ was crossed with 10 Japanese differential cultivars and the susceptible Chinese cultivar ‘Lijiangxintuanheigu’ (LTH). Allelism tests were conducted in the F₂ populations with rice blast races. The resistance of ‘Maowangu’ was governed by two dominant genes which were non-allelic to the resistance genes at seven loci: Pi-a, Pi-i, Pi-k, Pi-z, Pi-ta, Pi-b, and Pi-t. To identify the two resistance genes, two F₃ lines of ‘Shin 2/Maowangu’ segregating 3R:1S were selected for linkage tests in 1994. One was linked to marker genes C and Amp-3 on chromosome 6 with recombination frequencies of 35.8 ± 6.4% and 42.1 ± 6.2%, respectively, and the other to Amp-1 on chromosome 2 with a recombination frequency of 37.6 ± 6.0%. To confirm these results, two F₃ lines of ‘LTH/Maowangu’ were selected for linkage tests in 1995. The one was linked to Amp-3, and other was linked to Amp-1, with recombination frequencies of 36.9 ± 3.1% and 34.3 ± 3.2%, respectively. The two genes on chromosomes 6 and 2 were designated Pi13(t) and Pi14(t), respectively.     

无致病力hrp-突变体防治茄科蔬菜青枯病

为探索一条可有效控制茄科蔬菜青枯病的生防途径,以基因工程方法获得的无致病力青枯菌hrp-突变体为材料,针对茄科蔬菜青枯病进行有关生防体系、防治潜能及其机制的研究。结果表明,无致病力hrp-突变体对致病青枯菌无直接抑制作用,但可在植株体内定殖,并在预接种后阻止致病青枯菌的增殖。最优生防体系为采用改良蘸根接种法用无致病力hrp-突变体预处理24h后再接种致病菌,对青枯菌生理小种1引起的番茄、茄子、辣椒青枯病防治效果达64%以上,其中对hrp-突变体的野生致病菌株引起的番茄青枯病的防治效果最好,防效接近90%,对该野生致病菌接种辣椒、茄子引起的青枯病防治效果也在75%以上,且持效期长、稳定性好、安全无药害。     

鸡贫血病毒荷兰弱毒株基因序列比较研究

用ＣＡ５、ＣＡ６和ＣＡ７、ＣＡ８两对引物对鸡贫血病毒荷兰弱毒株进行ＰＣＲ扩增。将扩增产物１．５ｋｂ和０．８ｋｂ的ＤＮＡ片段分别克隆到ＰＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体质粒中,并进行核苷酸序列分析。通过与２６Ｐ４毒株进行核苷酸序列比较发现二者有３２个核苷酸的差异。荷兰和２６Ｐ４两毒株间ＶＰＩ蛋白质同源率为９７％,没有发生特异性变化;ＶＰ３蛋白质同源率为９５％,在Ｉ￣３０个氨基酸之间发生了特异性     

青枯病原细菌无毒菌株诱导番茄防御酶系及粗提液抑菌活性的影响

 用紫外诱变法获得的青枯无毒菌株诱导番茄,研究了诱导番茄细胞内防御酶系及组织粗提液抑菌活性的影响。结果表明:番茄经无毒菌株处理后,体内与抗病反应相关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及超氧化物歧化酶(SOD)等防御酶系活性均显著增加。无毒菌株可诱导产生植株体外和体内对致病菌有抑制作用的抑菌物质。表明青枯无毒菌株产生诱导抗性的机制可能是激活了植物本身的抗病代谢过程。     

融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

依据淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)主要保护性抗原CD8 T细胞表位VRRPQASGVYMGNLTAQ和卵清白蛋白(OVA)CD8 T细胞表位SIINFEKL,设计、合成两条编码LCMV和OVA CD8 T细胞表位的寡核苷酸片段,经退火后,克隆入绿色荧光蛋白表达质粒pYAGFP,经PCR扩增和序列测定分析,证实成功构建T细胞表位与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒pYAGFPL-O,将此重组质粒pYAGFPL-O转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,获得重组沙门氏菌X4550(pYAGFPL-O).用SDS-PAGE电泳测得重组菌表达的融合蛋白约为30kD.同时,荧光显微镜下观察到X4550(pYAGFPL-O)发出黄绿色荧光.这些结果表明LCMV和OVA T细胞表位已成功表达.重组菌X4550(pYAGFPL-O)的获得为研究沙门氏菌载体携带外源抗原的T细胞应答规律及调控机理打下了重要基础.     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。