二穗短柄草叶绿体RNA编辑位点的预测及其鉴定

RNA编辑是陆生植物叶绿体转录后基因表达调控的一种重要方式。为进一步探讨单子叶植物RNA编辑功能及其发生机制,本研究通过生物信息学方法,对二穗短柄草叶绿体的81个蛋白编码基因的RNA编辑位点进行了预测和鉴定分析,结果发现78个基因存在编辑位点,共检测到176个编辑位点,都是C到U的转换。其中ndhB最多,为14个编辑位点。为验证预测结果,利用blast工具比对了NCBI的二穗短柄草EST数据库,最终确定存在于17个基因中的34个编辑位点是真实存在的,其中19个为沉默编辑,15个为有效编辑。与5个不同单子叶禾本科物种18个蛋白编码基因的RNA编辑位点的比较发现,在rpoB-206位点,只有二穗短柄草发生了编辑,且只有ndhD-295(293)为部分编辑位点。     

短柄草Hsf家族全基因组鉴定、分类和高温响应

分析短柄草Hsf家族成员的进化关系,并进行分类;利用多种软件和在线工具分析短柄草Hsf的蛋白结构功能域和基因启动子区域的顺式作用元件;分析基因组信息,进行基因的染色体定位;利用荧光实时定量技术(qRT-PCR),分析短柄草Hsf基因在高温胁迫下的表达模式,鉴定出一些高温诱导表达的Hsf基因。     

小麦抗白粉病基因pm42的EST连锁图谱构建和比较基因组学分析

目的基因精细遗传连锁图谱的构建是图位克隆的基础,小麦功能基因精细遗传连锁图谱的构建依赖于比较基因组学分析。水稻和短柄草(Brachypodium distachyon)基因组序列是小麦比较基因组学分析和功能基因精细遗传定位的重要工具。本研究利用小麦、短柄草和水稻的基因组共线性关系对小麦抗白粉病基因pm42进行比较基因组学分析,明确了pm42基因所在2BS基因组区域与短柄草第1染色体和水稻第3染色体直系同源基因组区域的对应关系,开发出与抗白粉病基因pm42连锁的EST-SSCP (expressed sequence tag-single strand conformation polymorphism)标记CD452782和BF201235,EST-STS (expressed sequence tag-sequence tagged site)标记CJ674042、EB513371和CV771633,构建了pm42基因EST标记遗传连锁图谱,CJ674042、BF201235、CD452782和CV771633位于pm42近端粒侧,距离pm42的遗传距离分别为1.9、12.0、19.7和25.7 cM;EB513371位于pm42近着丝粒侧,与pm42的遗传距离为14.6 cM。整合原有的作图数据,构建了pm42基因的高密度比较基因组学遗传连锁图谱,pm42被定位于3.3 cM的区间,该区间对应于短柄草66 kb的基因组区域及水稻69 kb的基因组区域。该结果为抗白粉病基因pm42高密度精细遗传连锁图谱构建、分子辅助选择和基因聚合奠定了基础。     

普通小麦和短柄草AGAMOUS LIKE 6基因RNA干扰载体的构建

AGL6(AGAMOUS LIKE6)基因亚家族是植物MADS-BOX基因家族一个古老的亚家族,近年的研究表明,禾本科植物玉米(Zea maize)AGL6基因ZAG3、水稻(Oryza sativa)AGL6基因OsMADS6参与调控花的发育。OsMADS6还影响种子的发育。普通小麦(Triticum aestivum)和短柄草(Brachypodium distachyon)中AGL6基因的功能还不清楚。为解析小麦和短柄草AGL6基因的功能奠定基础,运用RT-PCR等分子生物学方法,克隆TaAGL6基因的cDNA序列,构建RNA干扰载体,同时分析TaAGL6基因的表达模式。结果表明:成功构建TaAGL6和BdAGL6 RNA干扰载体,小麦中有3个同祖AGL6基因,分别位于A、B、D基因组上,它们除了在花序中高水平表达外,在幼苗的根中也有一定表达。     

二穗短柄草异戊烯基转移酶(IPT)编码基因的进化及功能分析

细胞分裂素(CTK)是一类重要的植物激素,主要作用是引起细胞分裂,诱导芽的形成和促进芽的生长。此外,CTK能够通过参与细胞分化来调控根分生组织大小,对根系生长有负调控作用。异戊烯基转移酶(IPT)是CTK合成过程中的一个关键的限速酶,在高等植物中均以多同源拷贝形式存在。为了探寻二穗短柄草IPT基因的进化起源,并阐明同源基因间潜在的功能分化及其在根系生长过程中的生物学功能,首先,对拟南芥及二穗短柄草的IPT基因进行了序列比对和进化分析,其次,利用荧光定量的方法对二穗短柄草中各IPT基因在不同组织不同发育阶段的转录水平进行了定量分析,最后,通过构建IPT基因RNAi的表达载体,对二穗短柄草中多个IPT基因的转录进行了沉默干扰。结果表明,tRNA-IPT可能代表了IPT祖先基因的功能,而且是ATP/ADP-IPT基因的供体基因。二穗短柄草各IPT基因具有一定的组织表达特异性,大部分ATP/ADP-IPTs处于转录不活跃状态,而tRNA-IPTs在根部和叶部的表达量都很高。因此,IPT基因在单子叶模式植物二穗短柄草中可能采用了不同于拟南芥的方式发挥功能,其主要的发挥功能形式是tRNA类型。二穗短柄草转IPT-RNAi植株表现出根系增强的表型,说明在根系早期发育阶段,二穗短柄草ATP/ADP型IPT基因起到了一定的调节作用。由于IPT基因在早熟禾亚科物种中较为保守,本研究可为增强麦类作物根系发育与提高抗旱性提供必要理论基础。     

二穗短柄草BURP家族基因的鉴定与分析

BURP是一类植物特有蛋白,在生长发育和逆境防御中起着重要作用。为给后续的基因克隆、表达和功能验证奠定基础,根据二穗短柄草的基因组和蛋白质序列,利用生物信息学手段对BURP基因家族成员进行鉴定、染色体定位、序列分析和系统发育研究。结果表明,二穗短柄草有12个BURP基因,位于1~4号染色体上,在5号染色体上未见分布;BURP基因的全长为621~3 350 bp,具0~3个内含子,编码区全长621~2 316 bp,编码206~771个氨基酸,推导蛋白的等电点为5.02~9.51;12个BURP基因编码的蛋白分为5组,分别定名为RD22、PG1β、BURP-V、BURP-VI和BURP-VII,没有USP和BNM2类型的BURP蛋白;此外,根据4个半胱氨酸-组氨酸重复所间隔的氨基酸数量,二穗短柄草的BURP蛋白结构域可用CH/R-X10-CH-X25-36-CH-X22-25-CH-X8-W/F表示。     

二穗短柄草FRUITFULL1基因表达分析及RNA干扰和过表达载体的构建

为了揭示BdFUL1的生物学功能,利用生物信息学和分子生物学方法,分析二穗短柄草转录因子FRUITFULL1-2(BdFUL1-2)的结构、序列特征以及与不同植物AP1/FUL的亲缘关系,构建进化树。利用定量RT-PCR等分子生物学方法,分析非生物逆境和外源激素处理条件下两个转录本BdFUL1-1和BdFUL1-2的表达水平。结果表明:BdFUL1属于典型的植物MADS-box基因,与小麦的WFUL1有很近的亲缘关系;在高温、低温、干旱胁迫以及不同激素ABA、6-BA和SA处理下,BdFUL1-1的表达水平显著升高,暗示BdFUL1可能通过激素信号传导而参与响应非生物胁迫。同时,构建BdFUL1-1和BdFUL1-2的RNA干扰和过表达载体。     

二穗短柄草未成熟胚愈伤组织诱导及高频再生体系的建立

n以二倍体ABR 6和六倍体ABR 102二穗短柄草的幼胚为外植体,研究糖类、染色体组倍性和激素对愈伤组织诱导、分化及生根的影响。结果表明高效再生体系为愈伤组织诱导培养基：LS+2,4-D 2.5 mg•L-1+麦芽糖30 g•L-1+琼脂6.5g•L-1;愈伤组织继代培养基：LS+2,4-D 1.0 mg•L-1+6-BA0.2 mg•L-1+麦芽糖30g•L-1+琼脂6.5g•L-1;愈伤组织分化培养基：LS+KT 0.2mg•L-1+6-BA 0.5 mg•L-1 + CuSO4 0.6 mg•L-1+麦芽糖30g•L-1+琼脂6.5g•L-1;愈伤组织生根培养基：1/2 LS+IAA 0.6 mg•L-1 +麦芽糖20 g•L-1+琼脂7.0 g•L-1。优化了二穗短柄草愈伤组织培养条件,在含有30g•L-1麦芽糖的培养基上,愈伤组织出愈率最高可达96.67%,在含有0.2mg•L-1KT的培养基上,分化率最高为71.25%,进一步研究了影响短柄草再生的主要因素。     

二穗短柄草BdTOR基因的克隆及功能分析

在酵母、植物、动物和人类中,TOR是一个进化保守的重要调节因子,它通过整合营养和能量信号促进细胞增殖和生长。从二穗短柄草中克隆得到全长7 401 bp的Bd TOR基因,编码2 466个氨基酸残基,预测其具有HEAT重复域、FAT域、FRB域、激酶域、FATC域等保守结构域。实时定量PCR表明Bd TOR在二穗短柄草组织器官中相对表达量由高到低依次为幼穗幼苗根叶茎;Bd TOR及其激酶域的瞬时表达表明其定位于拟南芥原生质体的细胞核和细胞质,并在细胞质中区域化分布;Bd TOR具有促进根、叶生长,增加生物量,提高生长速率的功能;过表达Bd TOR可以回补雷帕霉素对Sc FKBP12过表达株系BP12的抑制;在雷帕霉素处理下Bd TOR能够与Sc FKBP12互作。     

新模式植物短柄草模式特性研究进展

短柄草(Brachypodium distachyon)是一种广泛分布于温带地区的禾本科植物, 基因组小、染色体少、DNA重复序列少、植株较矮、生育期短、种子数量多, 与小麦族植物一样具有二倍体、四倍体和六倍体, 且不需要严格的生长条件和栽培措施, 是小麦等早熟禾谷类理想的模式植物。近几年来, 国际上对短柄草开展了较多研究, 而国内对短柄草的研究尚属空白。本文综述了短柄草细胞遗传学、分子生物学、基因组学、组织培养和遗传转化等方面的研究进展, 对今后的研究和应用趋势进行了简要展望, 以促进国内对短柄草模式特性, 以及小麦等植物结构基因组学和功能基因组学的研究。