含GFP报告基因的伪狂犬病病毒上海株gE-gI基因部分缺失株的构建

在伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上，进一步构建了转移载体质粒，为PRV－SH的gE－gI基因部分缺失毒株的构建作准备，将gI和gE基因克隆入pUC18中构建pgEI载体，利用gE基因中的酶切位点缺失掉gE基因5′端363bp，并把录色荧光蛋白（GFP）基因表达盒插入到缺失部分。通过酶切鉴定，表明GFP基因已3插入到pgEI中，构建了含GFP的缺失转移载体pgEI-GFP。用DOTAP试剂将pgEI-GFP转染感染了PRV－SH株的兔肾（RK）细胞，待出现80％以上的细胞病变时收获病毒，并以GFP为标志，通过蚀斑法得到纯化重组病毒，命名为PFDE／DI。     

猪miR-124靶向IQGAP2调节巨噬细胞内沙门氏菌的增殖

[目的]明确猪miR-124与其靶基因IQGAP2间的表达调控关系,以及miR-124表达水平与猪巨噬细胞内沙门氏菌数量的关联,为揭示沙门氏菌在感染细胞内存活与增殖的机制提供理论依据.[方法]通过荧光素酶报告基因系统验证miR-124与IQGAP2基因的作用位点;再以GM-CSF诱导的猪巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)为试验材料,通过实时荧光定量PCR和流式细胞术测定沙门氏菌感染猪巨噬细胞中miR-124和IQGAP2基因的表达及巨噬细胞内沙门氏菌的增殖情况.[结果]miR-124结合位点野生型载体转染的荧光报告信号显著低于miR-124结合位点突变载体(P<0.05,下同),但共转染anti-miR-124序列后能显著增强miR-124结合位点野生型载体的荧光报告信号.经沙门氏菌感染后,猪巨噬细胞中的miR-124表达被激活,感染12、24和48 h后的相对表达量均显著高于沙门氏菌感染前(0 h),而IQGAP2基因表达水平呈显著下调趋势;在沙门氏菌感染猪巨噬细胞内,miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平呈明显负相关(r=-0.92).miR-124高表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞,但miR-124敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著低于正常巨噬细胞;IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞;此外,miR-124高表达+IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量与IQGAP2基因敲低表达处理组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于miR-124高表达组细胞.[结论]沙门氏菌感染猪巨噬细胞中的miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平及胞内沙门氏菌数量呈负相关,即沙门氏菌可通过上调miR-124表达靶向抑制IQGAP2基因表达,从而调节其在猪巨噬细胞内的增殖.     

杨树因伤诱导型启动子的克隆及功能分析

机械损伤或病虫害侵扰引起植物一系列防御相关基因的激活,其中一些是因伤诱导表达的．Ｂｒａｄｓｈａｗ等１９８９年报道了杨树Ｗｉｎ３基因家族中的一员,其编码产物类似于白薯和豆类胰蛋白酶抑制剂,并且是因伤诱导表达的。为了更全面的了解这一基因启动子在因伤介导表达中的作用,探讨其在基因工程用于控制外源基因表达的可能性,本文分别从欧洲黑杨（Ｐ．ｎｉｇｒａ）和美洲黑杨（Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）中扩增出ｗｉｎ３基因启动子ＷＩＮＰ（７０５ｂｐ）和ＷＩＤＰ（７９１ｂｐ）．这两个启动子与来自大肠杆菌的ＧＵＳ基因融合,通过根癌农杆菌Ｔｉ质粒转化系统引入烟草中．证实了ＷＩＮＰ和ＷＩＤＰ控制的ＧＵＳ基因的表达不仅在损伤部位,而且具有系统的因伤诱导效应．对８株转基因烟草的组织化学分析表明,其表达模式与以前的报道一致。无论是在受损伤组织还是完整组织中,ＷＩＮＰ的伤诱导活性总比ＷＩＤＰ高。这两个启动子需要进一步改造以增强其活性。     

血红素加氧酶1基因表达调控序列的克隆及应用研究

为了获得京尼平苷调节HO-1基因表达的直接证据,克隆了ho-1基因的表达调控序列,并将其构建到以荧光素酶为报告基因的p-GL-3质粒上,通过转染HEK293细胞,对京尼平苷调控报告基因的表达进行了分析,结果证实:京尼平苷能够剂量依赖的提高报告基因的表达水平,提示京尼平苷诱导HO-1水平上调与增强其转录有关.     

MrMYB1-MrbHLH1:一个有潜力的园艺植物转基因可视化报告基因

将杨梅果实中参与花色苷生物合成的转录因子编码基因MrMYB1和MrbHLH1同时搭载到双元表达载体的多克隆位点内,重组成双价表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法将其分别转入烟草、番茄和森林草莓,成功转化MrMYB1-MrbHLH1的烟草、番茄和森林草莓不定芽因大量积累花色苷而呈红色,与野生型或假阳性不定芽相比,表型差异明显;转化35S::MrMYB1-MrbHLH1的烟草和番茄植株中可显著积累花色苷呈红色,且该性状可稳定遗传。MrMYB1-MrbHLH1在3种园艺植物具有调控花色苷积累而使阳性转化植物部分组织器官呈现红色的功能,是1个有潜力的遗传转化可视化报告基因。     

植物基因捕获系统及其应用研究进展

随着人类和其他一些重要动、植物序列数据的快速积累,我们面临着如何鉴定这些序列数据所代表的生物学功能的巨大挑战。基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段,对于揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值。本文介绍了植物中的基因捕捉系统及其在植物分子生物学研究中的应用。     

大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其转化研究

杂交大豆是我国具自主知识产权的科研成果，具有广阔的应用前景。为解决杂交大豆制种过程中不育系易与保持系混杂的问题，我们开展了大豆叶绿体转基因的研究，目的是通过转基因的方法在不育系的细胞质中，植入筛选标记基因，以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列（GenBank X07675）设计引物，用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR，克隆到质粒pUC19中，并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间，以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。 aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3’序列，分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上，我们还将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上，得到pJY03与pJY04，并初步应用于烟草的叶绿体转化，获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗，PCR扩增出aadA基因的条带，并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达，由此证实了这一实验思路的可行性，为后期大豆叶绿体转化工作的顺利进行打下了良好的基础。     

绿色荧光蛋白基因在植病研究中的应用

综述了绿色荧光蛋白基因在植物病害研究中的应用及进展。重点分析了绿色荧光蛋白基因在病原菌的检测、侵染与定殖、致病基因的表达及构建抗性植株的筛选中的应用,提出了绿色荧光蛋白基因在应用中存在的问题以及在植物病害研究领域展现出的巨大潜力。