农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T₁代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L^-1 KT、0.5 mg·L^-1 6-BA和0.05 mg·L^-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L^-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L^-1 CuSO₄显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T₀代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T₁代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

Study on the Factors Influencing the Efficiency of Wheat Transformation

Wheat transformation efficiency is closely related to several factors such as receptor genotype, constructed plasmid and selection procedure after bombardment or co-cultivation. In our study, several kinds of antibiotics, which were normally used in plant transformation to the selection genes of nptⅡ, bar and hpt,were tested for the optimal concentrations for wheat transformation. The results showed that 25 - 50mg/L of geneticin (G418) was suitable for the selection of nptⅡ, kanamycin or neomycin was not suitable for use. 3 5mg/L of phosphinothricin (PPT) or biolaphos could be used for the selection of bar, 100 - 150mg/L of hygromycin for the selection of hpt. Yangmai 158 and Yangmai 10 with high tissue culture response and good agronomic characteristics were screened from 25 potential Chinese wheat cultivars. The concentration changing of selectable agent in selection medium was helpful to obtain enough regeneration plantlets with strong root system.     

用共转化法培育无选择标记转基因植物研究进展

介绍了用农杆菌介导的共转化法培育无选择标记基因转基因植物的原理、方法、影响因素以及其国内外研究进展.     

转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究

研究了转基因及常规水稻幼苗叶面喷施潮霉素B溶液后的反应。结果发现,常规水稻吸收潮霉素B后,叶片会出现以褐斑为特征的中毒症状。在50～100mgL浓度范围内,褐斑的数目和面积随时间和浓度的增加而增加,溶液中滴加DMSO可提高潮霉素对稻苗的毒性。浓度在75mgL及以上时,喷后第7天,处理的所有幼苗都出现症状。而浓度在50mgL时,个别幼苗经处理后未出现中毒症状。在上述浓度范围内,带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因水稻(克螟稻)幼苗均未出现中毒症状。苗期鉴定与抽穗前后成株期鉴定的结果相一致。讨论了叶面喷施潮霉素B溶液在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感转基因水稻突变体中的可能应用。     

剔除转基因植物中选择标记的研究进展

目前无选择标记技术已经成为基因工程中安全转基因研究方面的一个重要内容,转基因植物中标记基因的去除,一方面有利于消除公众对转基因的恐惧心理,另一方面有利于科学家向已转化植物中重复转入外源目标基因。文章对近几年出现的几种无选择标记技术作一综述,并对该技术的发展进行了展望。     

可定点整合的无筛选标记LacS基因表达载体的构建与鉴定

试验旨在构建一个能够定点整合且无筛选标记基因的半乳糖苷酶基因LacS表达载体.本研究以pEGFP-N1质粒为原始框架,通过PCR及限制性酶切位点在pEGFP-N1质粒的标记基因两端添加两个同向LoxP序列,在多克隆位点上游添加能够定点整合的attB序列,最后再将目的基因BC promoter-LacS-PolyA通过限制性酶切位点插入多克隆位点.每一步都进行PCR、酶切及测序鉴定.PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果也与相应寡核苷酸序列一致,证明各个基因片段正确地连接到载体相应位置.本试验成功构建了可定点整合的无筛选标记半乳糖苷酶基因表达载体pEGFP-N1-LacS.     

植物筛选标记基因应用进展

筛选标记基因在植物遗传转化中担负着区分转化体和非转化体的重要作用。合适的筛选标记基因及其相应的筛选剂是植物转基因成功的关键。综述了迄今为止人们在植物转基因研究中使用过的主要筛选标记基因。     

利用Cre/lox特异位点重组系统获得无选择标记转AtMYB12基因的马铃薯

类黄酮是植物产生的一类次级代谢产物的总称,长期食用含类黄酮的果实和蔬菜有易于人体健康,目前广泛种植的马铃薯品种中仅含有痕量的类黄酮。AtMYB12是拟南芥中鉴定的调控类黄酮生物合成的特异性转录因子,并在烟草和番茄中得到了功能验证。为了增加马铃薯中类黄酮的含量,本研究构建pX6-patatin：：AtMYB12无选择标记...     

Construction of Double Right-Border Binary Vector Carrying Non-Host Gene Rxol Resistant to Bacterial Leaf Streak of Rice

Rxol cloned from maize is a non-host gene resistant to bacterial leaf streak of rice. pCAMBIA1305-1 with Rxol was digested with Sca Ⅰ and NgoM Ⅳ and the double right-border binary vector pMNDRBBin6 was digested with Hpa Ⅰ and Xma Ⅰ.pMNDRBBin6 carrying the gene Rxol was acquired by ligation of blunt-end and cohesive end. The results of PCR, restriction enzyme analysis and sequencing indicated that the Rxol gene had been cloned into pMNDRBBin6. This double right-border binary vector,named as pMNDRBBin6-Rxol, will play a role in breeding marker-free plants resistant to bacterial leaf streak of rice by genetic transformation.