沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位的定位

用淋巴细胞杂交瘤技术研制成４株沙门氏菌属特异单抗ＣＢ８，ｄｅ７，ｃｃ６，ＤＤ４，在免疫转印试验中，证实它们所识别的抗原表位位于鞭毛蛋白上，ＥＬＩＳＡ相加试验及竞争试验显示，ＣＢ８和ｃｃ６与ｄｅ７，ＤＤ４识别的抗原表位不同，表明鞭毛蛋白的属共同抗原具有多种表位的特性。用胰蛋白酶消化鞭毛蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果出现两条新带，分子量分别为４２０００（Ｆ４２），２７０００（Ｆ２７），长时间消化，最终只剩下Ｆ２７条带，它可抵制该酶的消化。对该酶切样品的免疫转印结果表明，沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位出现于Ｆ４２和Ｆ２７上，而相应的沙门氏菌分型Ｈ抗原单抗或因子血清识别的表位也在Ｆ４２和Ｆ２７上都得到了证实。这为沙门氏菌鞭毛蛋白抗原的多样性及结构和功能研究提供了证据。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的B细胞抗原表位鉴定

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5能诱导机体产生免疫保护反应,同时可以用于特异性的血清学诊断,本试验选取P5蛋白进行抗原表位鉴定。首先通过PCR扩增P5F1（1～204aa）,P5F2（170～296aa）及P5F3（280～371aa）3个片段,PCR产物分别定向克隆到表达载体pET32a（＋）中表达纯化。根据ELISA和Western blotting结果确定P5F3片段（280—371aa）是OmpP5的免疫优势决定区。为了进-步对该免疫优势决定区进行抗原表住鉴定,设计了-套11个部分重叠的短肽,这些短肽覆盖全部280～371aa片段。每-个短肽合成1对寡核苷酸链,退火后插入表达载体pGEX-6p-1,与GST进行融合表达。用HPS阳性血清进行ELISA和Western blotting扫描,鉴定出其表位位于”。TGNTCDAVKGRKALIT351。通过序列分析证实该抗原表位在不同的HPS菌株中高度保守。本试验确定了位于HPSOmpP5上的-个抗原表位,为建立-种方便、快捷、适用于现地大规模样品检测的鉴别诊断方法奠定了基础,同时也为HPS新型亚单位疫苗的研制,以及研究病原茵感染和机体免疫过程中P5蛋白与宿主体内相应分子之间的相互作用提供了有用信息。     

旋毛虫肌幼虫排泄—分泌抗原诊断猪旋毛虫病的研究与应用

应用“ES”抗原和酶复合物对猪旋毛虫病进行了ELISA的诊断研究,其抗原是对Gamble(1984)的肌幼虫培养方法经过改进研制而成的.应用这种抗原和免疫制剂建立起来的酶联免疫吸附试验诊断方法,具有灵敏度高、特异性强、操作简便、容易判断等优点,改变了我国过去应用粗制虫体抗原诊断猪旋毛虫病的状况.通过对71头人工感染旋毛虫病猪血清的诊断,可获得100%的阳性检出率.对旋毛虫病流行区120万头猪的检测证明,患猪检出率达93—95%.对250头ELISA阳性猪与宰后检查对照,其诊断符合率为98%左右.     

细粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

【目的】克隆细粒棘球蚴(Eg)内质网膜蛋白4(Reticulon-4,RTN4)抗原基因,对其序列进行生物信息学分析。【方法】采集感染Eg的绵羊肝脏和肺脏,提取Eg头节总RNA为模板,对RTN4基因进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】Eg RTN4cDNA全长654bp,编码217个氨基酸,蛋白质分子质量为25.3ku,等电点为8.83。编码氨基酸序列中含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。经生物信息学软件预测,RTN4蛋白的抗原表位区主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位区域;含有2个高度疏水区,2个跨膜区,膜外区分别位于第1-47位和第171-217位。【结论】成功克隆了Eg RTN4基因,预测了其编码蛋白抗原的结构和表位。     

用猪囊尾蚴分段抗原对猪囊虫病生前的快速诊断

本试验采用硫酸铵分段沉淀法,将猪囊尾蚴的蛋白质分离为:粗抗原、p25、p25—55、p55—80、s80等五种抗原、采用平板凝集、试管凝集、琼脂扩散等方法,分别进行试验和分析,其结果以p25—55抗原效果为佳,对猪囊尾蚴病的生前诊断具有实用价值。     

创伤弧菌FJ03-X2胞外产物对欧洲鳗鲡的致病性和免疫原性分析

以70%饱和硫酸铵盐析法制备鳗源创伤弧菌生物1型高致病菌株FJ03-X2的胞外产物(ECPs),攻毒试验表明,该ECPs对鳗鲡无致病力;SDS-PAGE分析表明,该ECPs由约36 ku为主的系列蛋白条带组成。制备ECPs的免疫刺激复合物(ISCOMs),以20μg/尾的剂量腹腔注射免疫规格为15~20 g/尾的欧洲鳗鲡,ELISA分析表明,21 d和28 d时的血清抗体效价约为1∶1 280,免疫印记显示,ECPs中分子量为36 ku以上的蛋白成份可被免疫欧洲鳗鲡血清所识别,是构成ECPs的主要免疫原;免疫保护试验表明,免疫欧洲鳗鲡显示出较高的免疫保护力。试验结果也显示出,单纯以ECPs等剂量腹腔注射免疫欧洲鳗鲡,不能激发欧洲鳗鲡产生较高滴度的血清抗体,免疫欧洲鳗鲡也未能产生有效的保护性免疫应答。     

大肠癌p53的表达与病理、PCNA、CEA及p53、PCNA、CEA与淋巴结转移的关系

目的：研究大肠癌p53的表达与病理、增殖细胞核抗原（PCNA）、癌胚抗原（CEA）及p53、PC-NA、CEA与淋巴结转移的关系。方法：应用链霉菌素-生物素（SP）免疫组化法，观察44例经病理确诊的大肠癌石腊标本中的p53表达、PCNA的阳性率和CEA的表达型式。结果：大肠癌p53阳性表达率为52．3％；大肠癌p53阳性表达与性别、年龄及肿瘤的部位、分化程度和湿润深度无关（P＞0．05），p53阳性表达者其淋巴结转移率较阴性者高（P＜0．05）；p53阳性表达及有淋巴结转移者其细胞增殖活性分别较p53阴性表达及无淋巴结转移者高（P＜0．05）；p53阳性表达及有淋巴结转移者其CEA表型均以胞浆型和间质型为主（P＜0．05）。结论：检测p53和PCNA表达及CEA表型对判断大肠癌的恶性程度、预测其林巴结转移趋势和预后及指导临床治疗有重要价值。     

桔青霉素人工抗原合成及偶联比测定

[目的]建立一种快速准确测定人工抗原偶联比的方法。[方法]通过载体蛋白BSA合成桔青霉素人工抗原,用SDS-PAGE电泳法、紫外吸收法、质谱法对其进行鉴定。[结果]经过3种方法的鉴定,桔青霉素人工抗原偶联成功,紫外吸收法测得其偶联比为8.4,质谱法测得其偶联比为6。[结论]对3种供试方法比较发现,质谱法能够快速鉴定人工抗原而且能够准确测定人工抗原的偶联比。该研究为桔青霉素克隆抗体的制备及建立桔青霉素的酶联免疫检测方法奠定了基础。     

口蹄疫荧光抗体的制备与应用

用猪抗口蹄疫病毒IgG制备荧光抗体,检测口蹄疫病毒感染BHK-21细胞中的病毒抗原,结果表明,该方法可以检出口蹄疫病毒感染BHK-21细胞中的病毒抗原,荧光抗体的工作浓度确定为1：40,且这种荧光能被FMDV阳性血清特异性地抑制。用制备的荧光抗体检测感染口蹄疫病毒CS株和LB株的BHK～21细胞抹片和飞片,结果均为阳性,空白对照均为阴性。对于低代次的分离毒,即使感染细胞产生明显的CPE,采用反向间接血凝试验也不能检出收获细胞液中的病毒抗原,本试验弥补了这一缺陷。采用直接荧光抗体法可确定病毒在感染细胞中增殖的位置,可作为兽医临床诊断方法之一。     

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物（CTN-OH）;采用N, N-羰基二咪唑法（CDI）将CTN-OH与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。