Scu—PA／t—PA基因cDNA在小鼠体内的表达

将Ｓcu－ＰＡ/t－ＰＡ两种基因cＫＮＡ所构建的表达载体pＳＶ２－ＳcuＰＡ,pcＤＮＡ３－ＳcuＰＡ及pcＤＮＡ３－tＰＡ混合后注入小鼠骨骼肌,观察了基因混合注射在小鼠体内 的表达情况。体外凝血试验结果显示,质粒注射后第３天凝血时间开始延长,约两周后凝血时间延长幅度最大。第１８天体内诱导产生ＤＩＣ,体外凝血时间试验组仍较空白对照组延长一倍以上,抗凝效果明显。相等基因水平下,混合基因注射表达水平和单独基因注射没有     

减毒沙门菌介导的apo-tPA融合基因在鸡体组织的分布与表达

探讨以减毒沙门菌为载体,介导外源基因在动物体内的组织分布和表达的可行性。将编码人t-PA功能区的基因片段与鸡VLDLy组装前体apo-B100基因融合,定向克隆到荧光蛋白表达载体SV40启动子下游,构建pApo-tPA-GFP表达质粒。应用电转化法将pApo-tPA-GFP表达质粒转化减毒沙门菌,阳性减毒沙门菌经翅下静脉注入鸡体内,分别于注射后第1、2、3、4、5周随机剖检试验用鸡,无菌取内脏器官,经组织细菌培养、RT-PCR检测各脏器中基因分布,涂片荧光镜检基因表达情况。结果显示,在肝脏、脾脏和十二指肠均分离到沙门菌,PCR鉴定均为减毒沙门菌载体;RT-PCR检测在肝脏、脾脏、十二指肠中有目的基因存在;荧光检测在肝脏、脾脏中有荧光蛋白。结果表明,减毒沙门氏菌能够作为载体将目的基因有效的转入到动物体内,这一方法有望为动物转基因提供便捷、有效的途径。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA真核表达质粒的构建与鉴定

将组织型纤溶酶原激活剂基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。经酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,ｔ－ＰＡ基因的插向正确,可用于哺乳动物细胞和个体表达系统中表达。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

tPA体外纤溶活性及半定量检测方法的确立

在原有的纤维蛋白平板溶圈法 (fibrin agarose plate assay,FAPA)检测系统中引入纤溶酶原 (plasminogen) ,使该法检测组织型纤溶酶原激活剂 (tissue plasminogen activator,t- PA)的灵敏度提高 30倍以上 ,达到 0 .0 1ng(约0 .0 0 1IU )水平 ;并对不同反应时间、纤维蛋白含量、琼脂糖凝胶厚度下的溶圈结果进行对比研究。结果表明 ,37℃温育18～ 2 4h可以得到较满意结果 ;其他因素虽不同程度地影响溶圈出现时间及大小 ,但对其溶圈梯度及标准曲线无明显影响。从而确立了以 FAPA为基础的快速、灵敏、可靠的重组 t- PA体外纤溶活性半定量检测方法。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体的研究现状及进展

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种高效特异的溶血栓药物,但天然的t-PA存在半衰期短,有潜在的引起颅内出血的危险等缺点,因而限制了它的广泛应用。世界各国的科研人员利用了分子设计和基因工程等技术,构建了一系列的t-PA突变体,旨在提高对纤维蛋白的亲和力,延长半衰期,提高纤溶效率,减少颅内出血的危险。综述了t-PA的结构和功能、对t-PA结构的改造,以及一系列t-PA突变体的研究现状及进展情况。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备

[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。