重组腐败梭菌α毒素的制备与免疫效力评价

为了对重组腐败梭菌α毒素的免疫效力进行评价,本研究以表达重组腐败梭菌α毒素的大肠杆菌BL21(pET28a-CSA)为研究对象,对影响重组腐败梭菌α毒素表达量的条件优化后,将重组腐败梭菌α毒素(分为上清分泌形式与包涵体形式)、超声波裂解和未裂解诱导后的全菌制成铝佐剂灭活疫苗皮下注射免疫家兔后,检测家兔血清中和效价,利用1 MLD腐败梭菌毒素攻击免疫家兔。结果显示,pET28a-CSA/BL21培养至OD_600nm达到0.850～0.950时以0.40 mmol/L IPTG,37℃诱导6 h获得的重组腐败梭菌α毒素相对表达量较高,并且以包涵体和可溶性2种形式表达且以包涵体居多;除包涵体疫苗组血清中和抗体效价为6 MLD/0.1 mL外,其它可溶性、裂解菌苗和未裂解处理菌苗实验组均为8 MLD/0.1 mL,高于类毒素疫苗组和《中国兽药典》规定的1 MLD/0.1 mL,攻毒后各免疫组家兔均得到100%保护,而类毒素疫苗组保护率仅40%,空白对照组全部死亡。结果表明,本研究制备的重组腐败梭菌α毒素具有很好的免疫保护效果,尤以可溶性的重组腐败梭菌α毒素免疫保护最佳。本实验为羊快疫疫苗的研制提供了实验基础。     

腐败梭菌无毒重组α毒素的表达与免疫保护性分析

本研究旨在获得腐败梭菌无毒重组α毒素,并评价其免疫保护性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计和人工合成,获得了缺少第212-222位共11个氨基酸编码序列的基因片段（GCSA_Δ11）。将该基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中进行表达与纯化。利用Western blot方法检测获得的重组α毒素（rCSA_Δ11）与腐败梭菌天然毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测其毒力。随后,以rCSA_Δ11制备疫苗免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA_Δ11可溶表达比例可达46%,且能与腐败梭菌天然毒素抗血清反应。进一步的试验结果显示,rCSA_Δ11丧失了对小鼠的毒力,0.1 mL的一免兔血清可中和8~12个小鼠最小致死量（MLD）的腐败梭菌天然毒素;二免兔血清可中和32~45个小鼠MLD的腐败梭菌天然毒素。1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护。综上表明,无毒性的rCSA_Δ11保留了良好的免疫保护性,从而为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

山羊"猝死症"病原菌的分离鉴定

对 3只突然死亡山羊的脏器进行了细菌学检查 ,分离到一种革兰氏阳性大杆菌 ,单在或成双 ,多为短链 ,无荚膜 ,有运动力 ;进行厌氧培养 ,在普通培养基上菌落呈不规则网状 ,分枝从中央向四周延伸 ,边缘不齐 ;血液琼脂平板厌氧培养 48h ,形成边缘不整齐、微隆起、淡灰色、周围有β溶血环的菌落 ;经生化鉴定为腐败梭菌。该菌可致死小白鼠 ,对环丙沙星、阿米卡星等药物敏感。     

绵羊腐败梭菌与魏氏梭菌混合感染的调查与诊断

近几年,零散发生于兽医临床上羊只突然死亡的病例,经笔者深入调查及实验室病原分离,将其确诊为此病是由腐败梭菌和魏氏梭菌所引起。     

二重PCR方法鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌

用包含16S～23S rDNA间隔区和23S rDNA的部分序列作为气肿疽梭菌特异性标志,以α毒素部分序列作为腐败梭菌特异性标志,建立了鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌的二重PCR方法。结果显示：气肿疽梭菌C54-1株扩增出大小为509 bp的条带,腐败梭菌C55-1株、C55-16株均扩增出大小为148 bp的条带,均与预期吻合;而产气荚膜梭菌C57-1株、C59-37株,肉毒梭菌C62-4株,诺维梭菌C61-4株均未扩增出任何条带。扩增产物的测序结果进一步证实了本方法的特异性。菌株的生物学特性试验结果也符合相应气肿疽梭菌和腐败梭菌的特点。本研究所建立的二重PCR方法可用于气肿疽梭菌和腐败梭菌的快速鉴定。     

羊梭菌病多联灭活疫苗生产用厌氧培养基的研究

通过多次培养试验,研制成功了新的厌氧培养基.该培养基用于羊梭菌病多联灭活疫苗中的产气荚膜梭菌(B型、D型)和腐败梭菌的培养,细菌的产毒能力和免疫原性均达到了<中华人民共和国兽用生物制品规程>(简称<规程>)的要求,配制的疫苗成品检验全部合格.该培养基与<规程>提供的肉肝胃酶消化汤培养基相比,配制方法简单,节约人力和时间,所用试剂均可从市场购买,所需原料成本低廉,仅为肉肝胃酶消化汤培养基的21%～27%.     

湖羊黑疫快疫的研究：Ⅰ.病原诊断

自１９６４年起，浙江杭嘉湖地区湖羊发生了一种高发病率高死亡率的急性传染病，仅３个县的不完全统计在一年内即死去一万余头，经病原学研究证明此病主要由水肿梭菌、黑疫的病原所引起，较少的病例是由水肿梭菌和腐败梭菌混合感染所致，后者是快疫的病原，研究工作早在３０年前结束，但迟至今日始发表。