胚胎干细胞及种系嵌合体的研究进展

胚胎干细胞是着床前的囊胚内细胞团或早期胎儿的原始生殖细胞经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系 ,具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化潜能 ,体外培养时保持未分化状态 ,可以传代增殖。改变维持胚胎干细胞不分化的培养条件 ,胚胎干细胞可自发分化成多细胞结构。在一定诱导下 ,胚胎干细胞可向多个方向分化 ,并生成多种功能细胞。胚胎干细胞注入到胚泡期胚胎或与桑椹期胚胎聚合 ,可以参与包括性腺在内的各种组织的嵌合体的形成。胚胎干细胞在细胞分化与调控 ,胚胎发育 ,遗传病 ,肿瘤 ,免疫和组织或器官移植等研究中显示着广泛的应用前景。而种系嵌合体的获得是实现 ES细胞途径的决定步骤 ,低的种系嵌合率则是制约 ES细胞应用的关键。提高供体 PGCs在受体生殖腺中的比例 ,缩短 ES细胞的体外培养时间 ,以及注入早期发育阶段的受体胚胎等都能提高种系嵌合率。文章从多个方面综述了胚胎干细胞的最新研究成果 ,并着重以禽类 ES细胞为例论述了种系嵌合体的检测方法 ,种系嵌合率的影响因素以及提高种系嵌合率的方法     

人类胚胎干细胞与小鼠囊胚嵌合的探讨

【目的】探讨人类胚胎干细胞(Human embryonic stemcells,hESCs)能否在小鼠胚胎环境中生存并参与其各个组织器官的分化,为hESCs与小鼠囊胚嵌合的可行性研究提供依据。【方法】将154枚受精后3.5 d(3.5days postcoitum,3.5 dpc)ICR品系小鼠囊胚随机分为3组:试验组(注射hESCs)、模拟注射组(注射针仅刺破透明带及滋养层细胞,但不注射细胞和溶液)及对照组(未注射),于注射后培养24 h统计囊胚完全孵化率。将稳定转染增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的含有9~15个hESCs的小细胞团块,显微注射入3.5 dpcICR品系小鼠囊胚腔内,注射后分别于3,24,48,69,77,94和116 h,在普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞的定位与动态分布情况,并将嵌合体胚胎移植入假孕母鼠子宫内,分别于移植后第4天和第6天处死孕鼠,普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞在整个小鼠胚胎中的分布情况。【结果】注射后24 h,试验组和模拟注射组的囊胚完全孵化率分别为73.6%和77.1%,均极显著高于对照组(38.3%)(P<0.01),有88.9%(32/36)的胚胎中的hESCs迁移并定位在小鼠内细胞团(ICM)及其临近的滋养层细胞上;体外培养48 h后,EGFP阳性细胞数进一步减少;116 h后,只有1枚胚胎仍残留3~4个EGFP阳性细胞,且散在分布于ICM克隆之外。体内发育试验结果显示,将43枚注射后的嵌合体囊胚移植入6只代孕母鼠子宫内,获得了22枚脱膜,有17枚脱膜中含有胚胎,其中形态正常胎儿14枚,没有胚胎含有EGFP阳性细胞。【结论】hESCs很难与小鼠囊胚正常嵌合。     

逆转录病毒转染胚盘细胞制备嵌合体鸡胚的研究

 【目的】通过重组逆转录病毒体内感染源于第X期胚盘细胞的方法获得嵌合体鸡。【方法】将扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的开放阅读框插入逆转录病毒表达载体pour-pBabe中获得重组逆转录表达载体;采用磷酸钙转染法将其与包装载体pVSVG共转入293 10A1包装细胞中进行病毒包装,得到病毒原液经超速离心浓缩200倍后注入种蛋(第X期)胚盘下腔,孵化种蛋。提取孵化5.5天的鸡胚基因组DNA,进行PCR检测和Southern杂交检测。【结果】构建含EGFP完整开放阅读框的逆转录病毒表达载体pour-pBabe-EGFP,提取孵化5.5 d鸡胚基因组DNA,经PCR、Southern杂交检测,嵌合体阳性率分别为75%和66.7%。【结论】通过用重组逆转录病毒体内感染鸡胚盘细胞的方法可获得嵌合体鸡。     

Hybrid Variegation in Crosses between Pelargonium zonale (L.) l'Herit. ex Ait. and Pelargonium inquinans (L.) l'Herit. ex Ait.

In reciprocal crosses between Pelargonium zonale and Pelargonium inquinans uniformly green, uniformly bleached and variegated plants occurred among the F₁ progeny. The effect has been described as hybrid variegation and also as hybrid bleaching. Because of the differences among the reciprocal crosses, it is assumed that the zonale-plastids undergo normal development in hybrids, while the plastids of Pelargonium inquinans do not develop normally due to their interaction with the nucleus of the hybrid. Using the results obtained in the experiments, the development of zonale-hybrids from Pelargonium is discussed.     

猪ICM注人囊胚获得嵌合胚的研究

以湖北白猪囊胚为ICM供体,杜洛克猪囊胚为受体囊胚,进行嵌合胚的研究.采用免疫外科和显微外科两种方法,分离184枚供体囊胚的ICM.用酶将ICM分散,而后注入到受体囊胚的囊胚腔中,共获67枚嵌合胚,经体外短期培养,其中35枚嵌合胚恢复,恢复率为52.2%.将恢复的嵌合胚分别移入5头与供体囊胚猪同步的受体母猪子宫内,两头受孕,其中一头维持到分娩.产仔4头,但未见毛色嵌合现象.     

鸡鸭异种间转基因嵌合体的制备

为研究异种间嵌合体的制作方法及供体和受体的嵌合情况,同时探讨绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值。本研究利用脂质体介导法将外源pEGFP-N3质粒转入到北京鸭原始生殖细胞(PGCs)中,将转染后的PGCs以微注射法转移至受体北京油鸡的胚下腔,探索转基因鸡鸭嵌合体的制作方法。结果显示:PGCs在转染后6 h开始有外源基因的表达,体外培养24 h后获得了33.6%的转染效率。120枚蛋在整个孵化期中共有33枚鸡胚发育,但最终无孵化成活鸡。在13个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为10.8%。PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,8只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞。研究结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因禽类是可行的。鸭PGCs能够迁移并定居到鸡胚性腺中,并有可能在鸡性腺中增殖分化成有功能的配子。     

离子注入法诱变菊花及嵌合体分离的研究

采用离子注入的方法对2个地被菊品种自交种子进行辐射处理,对后代的种子发芽率,株高,冠幅,花色和花径等进行观察统计。结果表明:经过处理后的菊花形状均发生变异,M1代平均株高明显矮化冠幅增大;花径与亲本相比发生广泛分离,性状变异率在8%左右。在Fe~+注入株中出现花色嵌合体的现象,该嵌合体的特征是一朵花上出现2种颜色的相嵌现象,并且通过组培技术对嵌合体进行分离得到与母株性状相同花色不同的新菊花品种。     

组织培养快速繁殖鸡冠花嵌合体

采用无菌萌发的鸡冠花嵌合体苗的茎段,在MS+6-BA2mg/l+NAA0.1mg/l+琼脂0.6%+蔗糖3%培养基中诱导出丛芽,经切割繁殖,每个茎段又可产生多个芽。将芽转入MS+琼脂0.6%+蔗糖2%培养基中生根成完整植株。来源于同一嵌合体植株的试管苗群体中发生红色株(1.9%)、绿色株(17.2%)和嵌合体(80.9%)的分离。嵌合体苗经短日照处理后在试管开花,这对发展微型观赏植物提供了新途径。     

Salinity tolerant performance and genetic diversity of four rice varieties

Nuclear DNA content in 84 Hosta cultivars was measuredby flow cytometry. As an internal standard we used the closely related Agave americana, the latter was calibrated against other reference species. Propidium iodide values were 20%higher than DAPI values, indicating a lower AT/GC ratio for Hosta. Ten new tetraploid plants were found in addition to the only tetraploid known so far; H. ventricosa.Small forms of the tetraploid H. ventricosa turned out tobe triploid hybrids. Three other triploids were discovered. Threesupposed tetraploids turned out to be diploid. In five plantsthe ploidy levels of the germ layers L1 and L3 appeared to be different. In these cases thick leaves coincides with a tetraploid DNA content. The DNA contents as measured in theseploidy chimeras coincide with differences in leaf colour, thusgiving an opportunity to analyze the build-up of Hosta plants.In general, analysis of the nuclear DNA content can be used as a simple means to increase the possibilities for creating new cultivars in this economically important perennial.