凋亡素基因真核表达载体的构建及在人肿瘤细胞中的表达

为探讨凋亡素对肿瘤的基因治疗效果,构建了凋亡素基因的真核表达载体。将凋亡素基因重组入 ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 载体,并通过脂质体介导凋亡素在人喉癌、人肺癌细胞系中表达;通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 在转染细胞中检测到了凋亡素的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ,这为应用凋亡素进行肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

凋亡素基因的克隆

为了探索应用凋亡素杀死肿瘤细胞的可能性,用ＰＣＲ方法扩增了鸡贫血病毒（ｃｈｉｃｋｅｎａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ,ＣＡＶ）的ＶＰ３基因（凋亡素）片段,然后将该片段重组于ｐＵＣ１９载体,并进行了限制性内切酶鉴定与序列分析,证实该片段与鸡贫血病毒Ｃｕｘ－１株的ＶＰ３ＤＮＡ序列一致,该ＤＮＡ全长３６３ｂｐ,编码１２１个氨基酸。     

表达Apoptin基因抗肿瘤双特异性重组腺病毒的构建及鉴定

为研发一种安全、特异、高效的抗肿瘤基因治疗候选药物，本试验基于人端粒酶启动子（hTERTp）、人5型腺病毒复制必需基N（Ela）和特异性抑癌基N（Apoption），利用RAPAd．I腺病毒载体系统，构建了一种具有肿瘤特异性杀伤和特异性复制能力的双特异性抗肿瘤重组腺病毒Ad—VT。并利用人肝癌细胞（HepCr2）、人肺癌细胞（A549）、人宫颈癌细胞（Hela）、人胚胎肺细胞（WI-38）和非洲绿猿肾细胞（Vero）对hTERTp的肿瘤特异性进行鉴定。结果显示，hTERTp可在HepC-2、A549和Hela等肿瘤细胞内特异性启动外源基因的表达，而在WI-38、Vero等正常细胞内不能启动相关基因表达。用RT—PCR及Western—blot等方法对Apoptin基因和Ela基因的转录和表达进行了鉴定。结果表明，Ad—VT能够有效表达Apoptin和Ela等外源基因。     

凋亡素诱导的肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制 ,并贯穿于整个生命活动。细胞凋亡异常可导致一些疾病的发生 ,如肿瘤的发生。同时 ,细胞凋亡的可诱导性也为肿瘤治疗提供了新的思路。凋亡素是来源于鸡贫血病毒的一个小分子蛋白。它能够选择性地诱导肿瘤细胞的凋亡 ,而对正常二倍体的细胞无任何毒副作用 ,并且正常细胞对凋亡素具有耐受性。凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡既不需要依赖 p53 ,也不会被bcl-2的过表达所抑制。凋亡素还能诱导人成骨肉瘤细胞多药耐药株 R-OS-73 2的细胞凋亡。这些特点使凋亡素成为一种新型的候选抗肿瘤制剂。     

凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的构建及其稳定表达细胞株的建立

利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。     

凋亡蛋白融合基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

在获得凋亡蛋白融合基因重组质粒pMD18-T-EGF-PⅡ-Apoptin的基础上,成功地构建了重组表达质粒pET-28a-EGF-PⅡ-Apoptin,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,结果表明,表达蛋白带位于33 kD处,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白的40%.表达蛋白经透析袋电洗脱法纯化后,对獭兔进行常规免疫,应用ELISA检测到较高的多克隆抗体效价,表明此蛋白具有良好的抗原性.Westem blot结果显示,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合.     

凋亡素原核表达及纯化

为进一步研究凋亡素结构与功能和制备凋亡素单克隆抗体,本试验构建了凋亡素的原核表达载体pET-28a-VP3,并将该质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白.结果证明在E.coli BL21中正确表达了凋亡素,同时对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在1.4 kD处出现目的蛋白带与预期相符.     

凋亡素融合基因原核表达载体的构建及可溶性表达

在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-22b-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达。软件分析结果表明表达蛋白占菌体蛋白的20%,上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。     

凋亡素（apoptin）诱导人白血病细胞的．凋亡

为了观察凋亡素（apoptin)能否诱导白血病细胞发生凋亡，利用脂质体介导将凋亡素基因真核表达质粒转染白血病细胞系。通过琼脂糖胶电泳分析、电子显微镜观察，结果表明，凋亡素能促使白血病细胞发生细胞凋亡。