不同来源的超氧化物歧化酶部分理化性质比较研究

对4种不同来源的超氧化物歧化酶的部分理化性质进行了比较研究。结果表明:牛血Cu,Zn-SOD和rhCu,Zn-SOD对一些化学试剂的敏感性方面基本相似,rhCu,Zn-SOD的热稳定性最好,80℃水浴60 min后活力仍有56%;在pH 5.0～11.0的范围内,Cu,Zn-SOD的活力比较稳定,Mn-SOD在pH 5.0以下容易失活,在碱性条件下较稳定。螺旋藻Fe-SOD和rhMn-SOD热、酸碱的稳定性较低;Cu,Zn-SOD、Fe-SOD和rhMn-SOD对一些化学试剂和不同变性剂的敏感性有明显的差别。rhMn-SOD稳定性,对化学试剂的敏感性方面与天然原料来源的Mn-SOD基本一致。Cu,Zn-SOD和Mn-SOD、Fe-SOD相比较,理化性质有明显的差别。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA克隆测序及其分子进化研究

对牦牛Cu/Zn-SOD cDNA进行克隆测序。所扩增片段长度为842bp,编码区长度为459bp。扩增片段与奶牛Cu/Zn-SOD cDNA序列比较发现有16个碱基存在差异。通过与已知Cu/Zn-SOD cDNA序列的7个物种:人、猪、鼠、大鼠、奶牛以及马的cDNA序列的比较构建了分子进化系统树。对所得序列的ORF分析发现,牦牛Cu/Zn-SOD由152个氨基酸组成,并对氨基酸序列进行了比对分析。     

毕赤酵母表达铜锌超氧化物歧化酶中试工艺研究

正交设计优化铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母在摇瓶及30L发酵罐的诱导表达条件,用两步层析法纯化表达的目的蛋白,在不同温度下进行原液稳定性试验。用考马斯亮蓝检测蛋白含量,活性检测试剂盒检测目的蛋白活性。纯化后原液参照中华人民共和国药典三部2005版进行检测,用SDS-PAGE、HPLC检测纯度,免疫印迹法检测rhCu,Zn-SOD特异性,等点聚焦测定该酶等电点,地高辛法检测残余DNA含量,酶联免疫法测定残余蛋白含量。结果显示正交试验的大罐高密度发酵最适条件比摇瓶的最适条所获得的目的蛋白活性高8倍,纯化后,HPLC纯度为99.7%,原液比活性大于6.0×103 U/mg,各项检测指标达到生物制品检定标准。该酶在45、65、85、100℃的半衰期分别为240、120、30、15。具有良好的酶稳定性。本研究建立了发酵、纯化的中试工艺,获得高表达、高纯度及高比活的铜锌超氧化物歧化酶,为规模化生产奠定了基础。     

海兰褐鸡法氏囊中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及NOS cDNA克隆及序列分析

通过对海兰褐鸡法氏囊中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及iNOS cDNA克隆及序列分析,了解海兰褐鸡法氏囊中主要氧化-抗氧化酶的分布及其基因组成,为研究传染性法氏囊病及与法氏囊相关禽病的氧化-抗氧化发病机制奠定基础.结果显示,Cu/Zn-SOD、Mn-SODcDNA序列分别出现2个碱基的突变,iNOS cDNA序列与原始序列同源性为100％.海兰褐鸡法氏囊中存在Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及iNOS 3种与氧化-抗氧化相关酶,并且Cu/Zn-SOD、Mn-SOD cDNA序列具有新特征,iNOS在海兰褐鸡体内是稳定存在的;海兰褐鸡可能与康奈尔K系鸡具有相似的遗传背景.     

构建铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母转化子及其高表达分析

设计铜锌超氧化物歧化酶酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的铜锌超氧化物歧化酶基因真核表达载体;通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,高拷贝基因比低拷贝高2～8倍,表达活性高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,相对分子质量为40 000左右,低糖基化,均为分泌表达。West-ern blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0,30℃,1.5%甲醇诱导浓度诱导72h上清的目的蛋白表达最好。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定。本研究为中试工艺研究奠定了基础。     

犬布氏杆菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为检测犬布氏杆菌(Brucella canis)重组Cu/Zn-SOD蛋白的抗原性,本研究通过PCR方法扩增B.canis的Cu/Zn-SOD基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-SOD.将该质粒转化受体菌E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析,...     

杨梅铜锌超氧化物歧化酶基因（MrCu／Zn-SOD1）的原核表达及活性鉴定

为获得高表达杨梅（Morellarubra）铜锌超氧化物歧化酶（MrCu／Zn-SOD1）的工程菌,本实验采用RT-PCR技术从杨梅果实中分离扩增了MrCu／Zn．SOD1的cDNA序列（456bp）,将该基因重组到原核表达载体pGEX-2T中,酶切、测序分析表明,重组质粒pGEX-MrCu/Zn-SOD1结构正确。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。IPTG诱导表达分子量约41kD融合蛋白GST．MrCu／Zn．SOD1。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽亲和层析纯化,得到高纯度的GST—MrCu／Zn—SOD1。采用氯化硝基四氮唑蓝法和黄嘌呤氧化法分析其活性。结果表明,GST-MrCu／Zn-SOD1具有特异性SOD酶活性。     

Amino acid sequence of proteins induced in Fe-deficient stressed alfalfa (Medicago sativa L.) roots

Alfalfa (Medicago sativa L.) grows well in soils with a moderately high pH and dissolves insoluble iron in the rhizosphere. We have investigated active uptake mechanisms under Fe-deficient nutrient conditions and the effects of Fe-deficiency on plants. Previously, we observed that Fe-deficient alfalfa roots exuded many compounds (Masaoka et al. 1993) such as fiavonoids. We also identified a new compound “alfafuran” which is a phenol compound and is different from organic acids or phytosiderophore-type amino acid derivatives exuded by Fe-deficient plant roots. This compound is also very effective in dissolving ferric phosphate (Noguchi et al. 1994), suggesting that alfalfa may have developed several strategies against Fe-deficient stress including the exudation of organic compounds like alfafuran which accelerate the Fe³⁺-reducing activity on the root cell membrane to dissolve insoluble iron compounds. Suzuki et al. (1995, 1997) observed that in barley several peptide spots obtained by electrophoresis were induced under Fe-deficient stress when mugineic acid-family phytosiderophores were secreted from the roots. They suggested that these peptides control the mugineic acid synthesis and secretion. We examined the peptides induced in Fe-deficient alfalfa roots.     

甘蔗Cu/Zn-SOD的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因,并分析其序列特征、组织特异性表达及在不同逆境胁迫下的表达模式。【方法】以甘蔗桂糖28号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得Cu/Zn-SOD,采用生物信息学方法分析所推测的氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR研究Cu/Zn-SOD在不同组织及逆境条件下的表达情况。【结果】克隆获得甘蔗Cu/Zn-SOD,NCBI登录号为JQ958328,其开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,与禾本科植物聚于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明Cu/Zn-SOD在根、茎、叶中均有表达,为组成型表达,在叶中表达量最高;Cu/Zn-SOD在聚乙二醇（PEG）、NaCl、低温（4℃）和H2O2四种非生物胁迫下均诱导表达,表达模式因调控机制的不同而异。【结论】克隆获得Cu/Zn-SOD,其主要在甘蔗绿色组织中表达,其在铜/锌SOD超氧化物歧化酶的功能区域保守型很高,可能与甘蔗抵御渗透胁迫相关。     

养殖密度对池塘工程化循环水养殖大口黑鲈抗氧化力、组织结构及应激基因表达的影响

为研究池塘工程化循环水养殖模式下养殖密度对大口黑鲈（应激基因表达的影响,以初始体重（4.50±0.23）g的大口黑鲈幼鱼为研究对象,设置3个养殖密度组,分别为0.2 kg/m³（SD1）、0.4 kg/m³（SD2）和0.6 kg/m³（SD3）,每个密度组设3个重复,实验周期为120 d,分别在实验的第30天、60天、90天和120天采集样本并分析。结果显示,实验结束时的最终密度分别为5.64 kg/m³（SD1）、8.79 kg/m³（SD2）和11.21 kg/m³（SD3）。养殖前90 d,肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力在各密度组间差异不显著（<0.05）;30 d和60 d时肝脏丙二醛（MDA）含量未受到养殖密度的影响（<0.05）;各密度组间肠道淀粉酶、脂肪酶活力没有显著差异（ mRNA相对表达水平在30 d和60 d没有显著差异（<0.05）,SD1组肝脏<0.05）;切片结果显示,3个密度组实验鱼肝脏和肠道结构正常,未受到严重损害,SD3组实验鱼肝脏细胞间空泡稍增多,肠道杯状细胞变小,数量减少。综上所述,在本实验条件下,养殖后期,养殖密度会对加州鲈生理状态产生影响,高密度应激会导致鱼体抗氧化以及免疫功能受到抑制,肝脏、肠道组织产生轻微损伤,0.2 kg/m³密度组大口黑鲈的生理状况最好。综合考虑,池塘工程化循环水养殖模式下大口黑鲈幼鱼的放养密度以0.2~0.4 kg/m³为宜。