疯草内生真菌Undifilum oxytropis次级代谢产物分析

为阐明疯草内生真菌Undifilum oxytropis次级代谢产物的化学组成,为其生物活性研究和开发利用提供依据,以本实验室保存的疯草内生真菌Undifilum oxytropis为研究菌株,采用察氏液体培养基对该菌发酵培养30d,收集菌丝体和发酵液,按照植物化学成分传统预试方法进行预试。在此基础上用不同极性有机溶剂梯度萃取得到菌丝体和发酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相,经薄层色谱检测及气相检测方法对其次级代谢产物进行初步分析。系统预试表明,Undifilum oxytropis发酵产物中含有生物碱、蛋白质、酚类与鞣质、黄酮类、醌类、挥发油和油脂等物质;薄层色谱检测发现,Undifilum oxytropis发酵产物中至少含有5种化合物,且菌丝体和发酵液正丁醇相均有苦马豆素及其类似物存在;气相色谱分析Undifilum oxytropis发酵液中苦马豆素含量为5.17×10~(-3)g/L。疯草内生真菌Undifilum oxytropis发酵产物含有苦马豆素等多种次级代谢产物。     

产苦马豆素疯草内生真菌Undifilum oxytropis原生质体的制备和再生

以产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis NX-FEL001为供试菌株,研究了培养方式、菌龄、酶解时间和酶解温度等,对U.oxytropis原生质体制备和再生的影响。结果表明,U.oxytropis菌丝在质量分数为10g/L纤维素酶+10g/L蜗牛酶+1g/L溶壁酶组成的复合酶溶液,35℃恒温,80r/min振荡孵育3h左右,原生质体释放量最高;原生质体在YCM培养基上,22℃培养9d可以再生形成菌落,培养15d其再生率可达8.5%;原生质体在YCM培养基上再生后其菌落颜色与野生型U.oxytropis不一致,呈现白色;菌丝形态与野生型U.oxytropis相一致,经检测再生后菌丝仍然能够产生苦马豆素。U.oxytropis原生质体的制备,将为进行疯草内生真菌的遗传转化和基因操作研究提供重要工具,为进一步开展疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机制奠定了基础。     

宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定

对宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌进行分离和鉴定,为进一步研究疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机理提供菌种和奠定基础。分离并纯化黄花棘豆植物组织中的真菌,采用气相色谱质谱联用法对各菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能产生苦马豆素的内生真菌;紫外线照射和黑暗交替培养诱导内生真菌产孢;提取真菌DNA,扩增和测定真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD）、内部转录间隔区（internal transcribed space,ITS）和线粒体核糖体小亚基（mitochondrial small subunit,mt SSU）基因序列,进行同源性比对和遗传进化分析,对其进行种属分类和命名。本研究从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能产生分生孢子及分生孢子梗等结构;序列同源性和系统发育分析结果表明,该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis。     

产苦马豆素疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis的诱变筛选

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素（swainsonine,SW）能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移作用及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性,另一方面牛羊因大量误食疯草能导致中毒,对草原畜牧业健康发展造成了严重的危害,受到研究人员的广泛关注。但由于疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制尚不清楚,严重制约了后续通过生物发酵大量获得SW用以抗肿瘤机制研究与临床应用,以及通过基因工程手段对疯草进行脱毒育种,使疯草成为牛羊可食用、无毒的天然牧草。【目的】利用有效的研究手段,阐明Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制。【方法】以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株,分别采用紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变的3种诱变方式,在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛选研究。通过测定不同诱变方式和作用条件下对菌株的致死率,经发酵培养、连续5代传代培养、并采用α-甘露糖苷酶活性分析法检测诱变菌株产苦马豆素含量变化,优化确定了不同诱变方式下最佳诱变条件,并将优势突变菌株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）和改良察式液体培养基,连续培养32 d,测定并绘制了突变菌株D4和UD1的生长周期曲线。【结果】经上述3种诱变方式处理后,分别获得1株产苦马豆素含量变化较大、能稳定连续传代培养的突变菌株U4、D4、UD1。其优化的诱变条件,紫外辐照为辐照处理160 s,亚硝基胍化学诱变为亚硝基胍诱变剂量6 μL、诱变处理时间5 min,紫外辐照与亚硝基胍复合诱变为紫外辐照20 s,亚硝基胍诱变剂量2 μL,诱变处理时间5 min。突变菌株U4、D4、UD1较原始菌株,菌落形态偏小、中间凸起,菌落颜色呈微粉色或白色,且其产苦马豆素含量均有显著变化,其中U4突变菌株产苦马豆素量平均增加16.02%（P<0.01）、D4 突变菌株产苦马豆素量平均降低23.58% （P<0.01）,UD1 突变菌株SW产量平均增加21.87%（P<0.01）,但D4、UD1突变菌株生长周期与出发菌株一致,均为24 d。【结论】通过紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变方法,成功筛选出产苦马豆素含量变化较原始菌株差异较大的3株突变菌株U4、D4、UD1,这为后续利用高通量测序等分子生物学手段,在分子水平上阐释疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis关键基因、关键酶在其生物合成苦马豆素机制关系方面奠定研究基础。     

利用亚硝基胍诱变和高通量测序技术分析疯草内生真菌产SW生物合成通路

阐明产苦马豆素(swainsonine,SW)疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis中SW的生物合成通路,可以为生物发酵获得大量SW用于抗肿瘤应用和疯草的脱毒育种奠定理论基础和技术支撑。采用不同作用剂量的化学诱变剂亚硝基胍,在28℃,120r·min^-1与Alternaria Section Undifilum oxytropis孢子悬液分别作用5、10、15、20、25、30min,选取生长良好的菌株接种PDA培养基,连续培养发酵24d,应用α-甘露糖苷酶活性分析法检测菌丝及发酵液中SW含量,评价其传代及产SW稳定性。联合使用玻璃珠、液氮破壁法预处理菌丝,选用真菌基因组提取试剂盒提取原始菌株和突变株D4基因组DNA,经纯化、酶切、构建菌株DNA文库,并应用荧光定量PCR法检测评价文库构建质量,利用Ion torrent PGM^TM测序平台进行突变株和原始株高通量全基因组测序。结果表明,经化学诱变成功获得1株突变株D4,利用MIRA软件对高通量测序序列拼接、组装,分别获得突变株D4和原始株相关基因组片段19、21条,经BLAST、GO分析,注释到AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW的关键基因SwnK、SwnH2、SwnH1、SwnR和关键酶putative amino acid transporter、pyrroline-5-carboxylate reductase、formate/glycerate dehydrogenase catalytic、saccharopine reductase-like protein,并结合KEGG数据库,预测了AlternariaSection Undifilum oxytropis产SW可能的生物合成通路。本研究为揭示AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW机制作出了新的探索尝试。