重组日本血吸虫抱雌沟蛋白诱导的免疫机制研究

应用大肠杆菌表达日本血吸虫抱雌沟蛋白（Schistosoma japonicum gynecophoral canal protein, SjGCP）。将重组蛋白rSjGCP与FCA、ISA206、ISA70M三种佐剂混合后免疫BALB／c小鼠,分析重组抗原诱导的免疫保护机制。用流式细胞术检测三次免疫后小鼠体内CD4＋、CD8＋T淋巴细胞亚群和IL-2、IL-4、γ—IFN、IL-10等细胞因子,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗SjGCP特异性1gG抗体及其亚型lgG1水平。和空白对照组相比,GCP—FCA组和GCP-206组小鼠脾细胞中CD8＋T淋巴细胞比例显著下降,而GCP-70M组的CD4＋T淋巴细胞显著下降;GCP—FCA组、GCP-206组中IL-4、IL-10表达水平均显著上升;GCP—FCA组、GCP-206组、GCP-70M组血清中特异性IgG1亚型抗体含量显著升高。本研究为探讨重组日本血吸虫抱雌沟蛋白诱导的免疫保护机制积累了有价值的数据。     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫含EF手性结构域分子序列的分析和初步鉴定

为分离鉴定日本血吸虫含EF手性结构域分子及分析其序列结构特征,首先找到含有EF—hand结构域的分子,按照序列一级结构进行分类,之后进行生物信息学分析。然后用PCR方法以虫卵和成虫cDNA文库为模板扩增分类后的分子,构建重组质粒,诱导蛋白表达并纯化,选取14个纯化蛋白用Western blot进行初步免疫原性鉴定。结果269个原始含EF-hand结构域分子按照序列一级结构分为70个;成功表达和纯化了49个含EF手性分子,进化树分析将其分为9类;Western blot显示,14个纯化蛋白均可被日本血吸虫感染小鼠阳性血清识别。本研究结果为下一步采用这类分子进行动物保护性效果评价以及保护性免疫机制的研究奠定了基础。     

三种抗原对家畜日本血吸虫病诊断价值的比较

以日本血吸虫基因重组抗原LHD-Sj23／pGEX、可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen，SEA）及SEA经Sephadex G-200柱层析分离后得到的第一峰SEAl作为诊断抗原，应用ELISA检测人工感染日本血吸虫绵羊血清及自然感染日本血吸虫水牛血清。结果显示，三种抗原用于检测人工感染日本血吸虫绵羊血清的阳性符合率分剐为88．79％、98．15％、100％，阴性符合率均为100％；自然感染日本血吸虫水牛血清的阳性符合率分别为80％、80％、84％，阴性符合率分别为88．9％、93．3％、91．1％；三种抗原与伊氏锥虫病牛血清无交叉反应；检测感染日本血吸虫不同时间绵羊血清，发现感染6周后均被检出针对这三种抗原的特异性抗体，且SEA及SEAl在感染4周后即可检出特异性抗体。三种抗原的诊断效果差异不显著。     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。