大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—K99／LacZ基因重组的研究

将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

大肠杆菌耐热肠毒素b及其致动物腹泻的机理

介绍了大肠杆菌耐热肠毒素b（STb）的编码基因、理化性质、免疫学特征、分泌特征、毒性相关氨基酸残基、空间结构、膜受体以及STb致动物腹泻的机理。认为STb是一种十分重要的肠毒素，应进一步加强对STb及其致腹泻机理的研究。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ对实验性动物高胆固醇血症影响的研究

在建立试验用高胆固醇血症大鼠模型的基础上,观察用植物乳杆菌ST-Ⅲ制成的三个不同剂量的ST-Ⅲ活性乳对大鼠血脂水平的影响。动物实验表明:三个剂量的ST-Ⅲ活性乳均可显蓍降低大鼠血清胆固醇(TC)的含量(P<0.01),但对甘油三酯(TG)的降低作用不显著(P>0.05)。高剂量的ST-Ⅲ活性乳可显著提高大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)含量(P<0.01)。因此认为ST-Ⅲ活性乳具有辅助降血脂的功能,特别对高胆固醇血症具有良好的功效。     

ST融合蛋白的酵母表面展示及其对大鼠小肠黏膜结构的影响

本试验旨在获得能够将大肠杆菌ST融合蛋白展示在酿酒酵母表面的重组酿酒酵母基因工程菌并探究其对大鼠小肠黏膜结构的影响。将estA和estB基因克隆至pYD1质粒中,构建重组质粒pYD1-estA-estB,应用酵母表面展示技术获得EBY-100/pYD1-estA-estB重组酵母基因工程菌。选取36只SPF级SD大鼠,随机分为空白对照组、工程菌组、酵母菌组,分别灌胃生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液,持续灌胃21d后连续3d灌胃大肠杆菌H10407菌液,取各组大鼠的十二指肠、空肠、回肠制作切片,观察各段小肠绒毛的长度、宽度、隐窝深度及绒毛长度/隐窝深度(V/C)进行统计分析。利用ELISA、real-time PCR技术观察肠道黏膜中的SIgA、IL-2、IL-4和IFN-γ含量变化。结果显示,通过免疫荧光试验证明大肠杆菌ST融合蛋白成功在酿酒酵母表面展示;灌胃21d时,与空白对照组相比,工程菌组及酵母菌组的十二指肠绒毛长度、V/C值显著升高(P0.01),工程菌组绒毛宽度显著升高(P0.05);空肠绒毛长度、V/C值显著升高(P0.01),隐窝深度显著下降(P0.05);工程菌组和酵母菌组的回肠绒毛长度及V/C值显著升高(P0.01)。灌胃大肠杆菌后,各组与灌胃前相比,空白对照组及酵母菌组的十二指肠与空肠绒毛长度、V/C值显著下降(P0.01),空肠隐窝深度显著升高(P0.01),回肠V/C值显著下降(P0.01);工程菌组无明显变化。灌胃21d,工程菌组与酵母菌组的SIgA、IL-2、IL-4和IFN-γ含量均显著高于空白对照组(P0.01);攻毒大肠杆菌后,空白对照组及酵母菌组的SIgA、IL-2和IL-4含量均显著下降(P0.01),各组的IFN-γ含量显著升高(P0.01)。结果表明,EBY-100/pYD1-estA-estB重组酵母基因工程菌不仅具有酵母菌的益生作用,能促进小肠黏膜发育,而且对产肠毒素大肠杆菌引起的肠道黏膜损伤有一定的保护作用。本试验为新型微生态制剂的研发提供依据。     

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）K88的热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin，LT）基因进行无痕敲除并获得K88 LT^-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列，并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段；将供体片段转化至ETEC K88，同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统，对LT基因进行敲除；通过PCR验证获得了K88 LT^-缺陷菌株，并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示，λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段，CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除，最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明，K88 LT^-缺陷菌株的溶血能力丧失，并且生长速度比野生型菌株减缓，LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT^-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。     

丁酸梭菌介导mTOR信号通路调控猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制

本试验旨在研究丁酸梭菌（CB）介导雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调控产肠毒素大肠杆菌K88（ETEC K88）感染猪肠上皮细胞（IPEC-J2）炎症反应的分子机制。按试验步骤处理细胞,利用1×103 cfu/mL 的ETEC K88感染IPEC-J2以及400 nmol/L的mTOR抑制剂处理IPEC-J2,到达作用时间后,分别收集细胞及培养上清,然后按照猪肿瘤坏死因子（TNF-α）和猪白细胞介素-8（IL-8）检测试剂盒说明书进行细胞因子检测,以及使用荧光定量PCR（qPCR）法进行ZO-1、occludin和mTOR表达量的检测。结果表明：与ETEC组相比,抑制剂+ETEC组、CB+ETEC组和抑制剂+CB+ETEC组ZO-1和occludin的表达量均显著升高,或有升高趋势,ZO-1的表达量分别升高了86.59%、31.48%和133.98%,occludin的表达量分别升高了69.34%、18.63%和87.52%,而mTOR的表达量分别降低了40.81%、11.62%和52.43%。与CB+ETEC组相比,抑制剂+CB+ETEC组在mTOR活性被抑制后ZO-1和occludin的表达量极显著升高了77.97%和58.07%,而mTOR的表达量极显著降低了46.18%,CB与抑制剂协同逆转ETEC造成的紧密连接蛋白表达下降。综上所述,ETEC K88能够激活mTOR信号通路,而CB通过介导mTOR信号通路能够降低ETEC K88感染IPEC-J2引起的炎症反应,并提高紧密连接蛋白的表达量,从而减轻细胞损伤。 [关键词] 猪肠上皮细胞|丁酸梭菌|产肠毒素大肠杆菌K88|mTOR信号通路|肠道健康     

猪细小病毒S-1A株对细胞的适应性及其培养条件的优化

将猪细小病毒S-1A株在不同的细胞中培养,测定病毒含量,以确定适合猪细小病毒S-1A株增殖的细胞。结果表明：猪细小病毒S-1A株能在猪肾传代细胞系(PK-15)、猪肾原代细胞(PK)、猪睾丸细胞(ST)和仔猪肾细胞(IBRS-2)中生长增殖,不能在幼仓鼠肾细胞系(BHK-21)、绿猴肾细胞(Vero)和鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖;当ST细胞生长至2/3单层时,将猪细小病毒S-1A株种毒液100倍或1000倍稀释后接种ST细胞,37℃培养96～144h,获得的病毒载量最高。