大豆凝集素在不同种属动物小肠中残留、结合和内吞特点的比较研究

选取5种动物为试验对象,生理年龄均在1/2性成熟期,每种动物4头,猪(长白,70 d)、羊(小尾寒羊,60 d)、狗(比格犬,80 d)、兔(日本大耳白,75 d)和鸡(爱拔益加,75 d)。采用体内原位结扎灌注肠段的方法研究不同浓度大豆凝集素(SBA)在不同种属动物小肠中的残留、结合和内吞特点。动物禁食24 h后,注入麻醉剂,剪去腹部体毛,打开腹腔,结扎空肠前段,(各种动物以空肠前段1/3处相对位置开始结扎)。用30 m L(39±1)℃的生理盐水冲洗隔离的肠段,以冲洗肠段内残余的食糜,分别结扎4段5 cm长的肠段,用注射器分别输入含不同浓度SB(A 0、0.5、1.0 m g/m L和3.0 m g/m L)的Krebs液。灌注时间8 h。试验结束后,采用间接抑制ELISA方法检测3个指标:灌注液中SBA的残留率,肠黏膜表面SBA的结合率,进入小肠壁的SBA的内吞率。结果表明:大豆凝集素在动物小肠中的结合特点存在种属差异;比较而言,SBA在猪和狗小肠中的内吞率和结合率高于羊,兔和鸡的内吞率也较大,且SBA的不同浓度对其在小肠壁上的内吞也有较大影响,低浓度时SBA的结合率和内吞率较大。     

大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究

本文旨在测定纯化的大豆凝集素对兔和鸡小肠上皮细胞和红细胞的凝集活性。测定大豆凝集素对红细胞的凝集能力时,采用2%兔红细胞悬液,测定了使兔红细胞50%凝集的蛋白质浓度。测定对兔小肠上皮细胞的凝集能力时,采用荧光标记SBA与新鲜小肠上皮细胞结合后,观察荧光显微镜下荧光结合细胞比例的方法定量。经血凝试验结果表明,使兔红细胞50%凝集的SBA蛋白质浓度为2.50~3.69μg/mL,而SBA对鸡的红细胞没有凝集作用。SBA对兔小肠上皮细胞有结合能力,结合率为30%左右。试验结果说明大豆凝集素的血凝活性具种属特异性,用SBA与小肠上皮细胞的结合率作为评价其抗营养活性的指标具一定可行性。     

大豆针刺后SBA定量方法的研究

近年来,人们发现针刺会引起植物体内一定物质的变化,如凝集素含量的变化。欲知其量变规律,首要问题是建立快速、易行、灵敏、准确的定量方法。本研究以此为目的,建立了大豆针刺后SBA定量的全套方法,即火箭免疫电泳定量法。     

N‐Acetyl‐d‐galactosamine prevents soya bean agglutinin‐induced intestinal barrier dysfunction in intestinal porcine epithelial cells

Soya bean agglutinin (SBA) is a glycoprotein and the main anti‐nutritional component in most soya bean feedstuffs. It is mainly a non‐fibre carbohydrate‐based protein and represents about 10% of soya bean‐based anti‐nutritional effects. In this study, we sought to determine the effects of N‐Acetyl‐D‐galactosamine (GalNAc or D‐GalNAc) on the damage induced by SBA on the membrane permeability and tight junction proteins of piglet intestinal epithelium (IPEC‐J2) cells. The IPEC‐J2 cells were pre‐cultured with 0, 0.125 × 10^?4, 0.25 × 10^?4, 0.5 × 10^?4, 1.0 × 10^?4 and 2.0 × 10^?4 mmol/L GalNAc at different time period (1, 2, 4 and 8 hr) before being exposed to 0.5 mg/ml SBA for 24 hr. The results indicate that pre‐incubation with GalNAc mitigates the mechanical barrier injury as reflected by a significant increase in trans‐epithelial electric resistance (TEER) value and a decrease in alkaline phosphatase (ALP) activity in cell culture medium pre‐treated with GalNAc before incubation with SBA as both indicate a reduction in cellular membrane permeability. In addition, mRNA levels of the tight junction proteins occludin and claudin‐3 were lower in the SBA‐treated groups without pre‐treatment with GalNAc. The mRNA expression of occludin was reduced by 17.3% and claudin‐3 by 42% (p < 0.01). Moreover, the corresponding protein expression levels were lowered by 17.8% and 43.5% (p < 0.05) respectively. However, in the GalNAc pre‐treated groups, occludin and claudin‐3 mRNAs were reduced by 1.6% (p > 0.05) and 2.7% (p < 0.01), respectively, while the corresponding proteins were reduced by 4.3% and 7.2% (p < 0.05). In conclusion, GalNAc may prevent the effect of SBA on membrane permeability and tight junction proteins on IPEC‐J2s.     

大豆凝集素(SBA)含量遗传分析与QTL定位

大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)为大豆中含量较高、作用较强主要抗营养因子之一,影响大豆食品和饲料安全,降低或去除大豆籽粒和产品中凝集素成为大豆食品和饲料工业亟待解决问题。文章以合丰45号(高SBA含量)×太平川黑豆(低SBA含量)杂交组合及衍生201个稳定株系组成的F78重组自交系(RIL)群体为试验材料,在3年(2011~2013)1个样点(哈尔滨)种植环境下对大豆凝集素含量作遗传模型和QTL分析。结果表明,SBA含量符合2对主基因+多基因混合遗传模型;利用134对多态性SSR引物扩增RIL群体,构建遗传图谱,对SBA含量相关作QTL分析。共检测到4个与SBA含量相关QTL,每个QTL均重复检出2次,稳定性较好,其中SbaHTC1-1(Satt139~Satt578)和SbaHTD1b-1(Satt537~Satt189)2个QTL位点两年检测结果加性效应值均达显著水平,且遗传贡献率较高,为主效QTL。利用分子标记遗传图谱,定位与SBA含量相关QTL,为改良大豆凝集素含量提供理论依据和技术支持。     

高亲和力大豆凝集素单抗制备及免疫学特性鉴定

为制备高亲和力的大豆凝集素(SBA)单克隆抗体,本试验以50 μg SBA蛋白/200 μL乳化液/只的剂量免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和灵敏性。选择血清效价和灵敏性较好的小鼠进行细胞融合。通过有限稀释亚克隆筛选出能稳定分泌SBA单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法批量制备SBA单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,SBA免疫的4只小鼠中,1号小鼠效价最高且灵敏性最好,半数抑制浓度(IC₅₀)为571.4 μg·L^-1。选取该小鼠进行细胞融合,并最终得到1株杂交瘤细胞,命名为5B4E10。制备的SBA单克隆抗体的效价达到1∶409 600 以上,IC₅₀为82.04 μg·L^-1,亚型为IgG1型,亲和力常数(Ka)为1.83×10⁹ L·mol^-1。且该抗体与大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和其他抗营养因子无交叉反应。本研究结果为建立大豆及其制品中SBA的免疫学检测方法奠定了良好的抗体基础。     

大豆凝集素对不同种属动物T、B淋巴细胞增殖功能影响的比较研究

用纯品大豆凝集素(SBA)分别对来自猪、狗、羊、兔和鸡等不同种属动物血液中的T、B淋巴细胞进行刺激,通过MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法检测其增殖功能,同时用常规的有丝分裂源刀豆素(ConA)和脂多糖(LPS)分别刺激T和B淋巴细胞作为对比,从而研究SBA对不同种属动物免疫功能的影响.结果表明:SBA对狗、鸡和兔T和B淋巴细胞的刺激指数(SI)显著低于ConA和LPS对照组(P<0.05),对猪的SI虽低于对照组,但差异不显著(P>0.05),对羊的SI略高于对照组,差异也不显著(P>0.05).SBA对不同动物之间T、B淋巴细胞SI的影响也有差异,其中都以鸡的最高、羊的最低为显著特征;SBA对同一种动物T和B淋巴细胞增殖功能的影响存在差异,SBA对兔、狗和猪T淋巴细胞的SI高于B淋巴细胞,而羊和鸡恰好相反.SBA对不同种属动物T、B淋巴细胞的增殖功能均有影响,尤其是对狗、兔和鸡的影响较大,而且除羊之外,其它种属动物T、B淋巴细胞的增殖功能都受到不同程度的抑制,揭示出不同种属动物免疫细胞的糖基化模式、细胞分化过程及信号传导机制不同.     

猪子宫大豆素(SBA)受体细胞和肥大细胞观察

本研究用HRP—SBA标记技术、甲苯胺染色法及甲苯胺蓝和HRP—SBA双重染色技术,观察了猪子宫大豆素(SBA)受体细胞和肥大细胞.发现SBA受体细胞和肥大细胞,形态相似,但两者在子宫壁内的分布和数量不同.双重染色证明,SBA受体细胞和肥大细胞是存在猪子宫内膜的不同细胞.     

鸡小肠上皮细胞表面大豆凝集素受体的标记

以0日龄海蓝褐蛋鸡为材料,用胶原酶结合组织块培养的方法分离培养了鸡小肠上皮细胞,通过抗角蛋白单克隆抗体对分离的细胞进行纯度鉴定,并用荧光标记大豆凝集素对已鉴定的细胞大豆凝集素结合位点进行了标记.结果表明:试验获得了鸡小肠上皮细胞原代培养物纯度＞90%,可用于后续试验,荧光标记表明细胞表面存在大量的大豆凝集素受体.