香蕉ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及毒性与自激活效应检测

用PCR技术获得香蕉ROP1基因片段,构建酵母双杂交系统表达载体pGBKT7-ROP1,测序正确后将重组质粒导入AH109酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.结果表明,用PCR技术获得了正确的ROP1基因片段,并正确构建了ROP1基因的酵母双杂交表达载体,并转化到AH109酵母菌株中,含诱饵载体的AH109在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,含诱饵载体的AH109在His、Trp二重营养缺陷平板上不能生长,说明对报告基因无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统筛选与ROP1蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因的克隆与表达分析

【目的】对蒺藜苜蓿ROP基因进行克隆与表达分析,为深入研究ROP基因在豆科植物与根瘤菌共生互作过程中的功能提供理论依据。【方法】依据拟南芥11个ROP保守序列特征和蒺藜苜蓿数据库信息,同源克隆蒺藜苜蓿的MtROP9基因,采用生物信息学方法对该基因序列进行分析,并采用半定量RT-PCR法,对MtROP9基因在蒺藜苜蓿不同组织及根瘤菌侵染后不同时间根系中的表达水平进行检测。【结果】从蒺藜苜蓿根系中克隆到了MtROP9基因的cDNA序列,全长为947 bp,编码209个氨基酸。序列分析表明,MtROP9具有ROP蛋白典型的结构特征,并与拟南芥AtROP9、水稻OsRac2、葡萄VvROP9、玉米ZmROP6和ZmROP7具有高度的相似性。MtROP9基因具有一定的时空表达特性,在根系和花中表达水平较高,在茎和根瘤中表达水平相对较低,在叶中几乎不表达。在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生互作的早期,MtROP9基因能够被根瘤菌侵染诱导表达,在根瘤菌诱导处理不同时间的根系表达水平不同。【结论】克隆了蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因。MtROP9基因可能参与了豆科植物与根瘤菌共生互作早期信号的调控。     

弓形虫ROP2基因在大肠杆菌内高效表达条件的优化

采用SDS-PAGE方法检测弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白(Rhoptry protein)ROP2基因原核表达质粒在大肠杆菌BL21Codon Plus中的表达量。通过改变菌体密度、诱导剂浓度和诱导时间进行高效表达条件的优化。结果显示,在菌体密度D600nm为0·6、IPTG浓度为0·4mmol·L-1和诱导表达3.5h时,融合蛋白的表达量最大,达到159mg·L-1培养液。这为利用重组ROP2研究和制备弓形虫病的诊断抗原奠定基础。     

小麦幼叶ROP GTPase提取方法的优化(英文)

所有RhoGTPase组成一个特殊的亚家族,命名为ROP GTPase,这个家族参与并调控肌动蛋白细胞骨架的重组等一系列信号转导过程。小麦ROPGTPase的高效纯化技术和手段是对其功能和性质等进行研究的重要基础和关键,并且这对小麦ROP GTPase关于信号转导以及F-actin的研究有着极为重要的理论和实践意义。采用凝胶过滤层析和分辨率较高的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)等技术对小麦的ROP蛋白进行了提取、纯化和鉴定。在小麦幼叶ROPGTPase的提取中,初期蛋白质样品使用硫酸铵进行盐析脱盐并去除杂质,在提高目的蛋白纯度的同时也去除了一部分非目的蛋白,缩小了蛋白质的分子量范围。获得的蛋白样品提取液加入SephadexG25进行浓缩,浓缩后的蛋白使用紫外分光光度计进行纯度鉴定,测得蛋白质的纯度比较高,经凝胶过滤层析洗脱后利用SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定,得到了较为清晰的电泳图谱,目的蛋白质的含量有所提高,并且可有效去除其他杂蛋白的干扰,为进一步对小麦ROP蛋白功能和性质的研究提供了一定的理论和试验基础。     

蒺藜苜蓿小G蛋白ROP在共生过程中的作用:1.MtROP5的克隆和表达分析

【目的】对蒺藜苜蓿ROP进行克隆与表达分析,为深入研究ROP在共生互作过程中的功能提供理论依据。【方法】通过比较基因组学和RT-PCR方法克隆了蒺藜苜蓿的MtROP5,采用半定量RT-PCR方法检测了MtROP5在蒺藜苜蓿不同组织中的表达水平,采用荧光实时定量PCR方法检测了MtROP5在根瘤菌侵染宿主植物根系后72h内不同时间阶段的表达水平。【结果】从蒺藜苜蓿中克隆了含有MtROP5完整编码区的cDNA序列,长度826bp,编码197个氨基酸。序列分析表明,MtROP5编码的蛋白具有典型的ROP蛋白特征结构域,与其它几种植物中ROP蛋白具有高度的同源性和相似性。半定量RT-PCR分析表明,MtROP5在蒺藜苜蓿的根、茎、叶、花、根瘤中均有表达,茎和花中表达量最高,根和根瘤中次之,在叶中表达最弱。荧光实时定量PCR分析表明,与未接种根瘤菌的对照处理相比较,MtROP5在根瘤菌侵染的72h内不同时间阶段的根系中都增强表达。【结论】克隆的cDNA序列是一个蒺藜苜蓿小G蛋白ROP,推测MtROP5可能在共生互作的早期信号传导过程中行使一定的调控作用。     

蒺藜苜蓿小G蛋白ROP在共生过程中的作用:2.MtROP5调节根毛生长发育的功能分析

【目的】对蒺藜苜蓿MtROP5的功能进行研究,为阐明植物ROP在共生互作过程中的调控机制奠定基础。【方法】采用PCR方法克隆MtROP5的启动子序列,并构建了MtROP5的相关表达载体。利用发根农杆菌介导的遗传转化方法,对MtROP5启动子的表达模式以及MtROP5的功能进行了分析。【结果】克隆了MtROP5翻译起始位点上游2.1kb左右预测的启动子序列,MtROP5启动子驱动GUS在根系的各个部位中都有表达,在维管束组织和侧根起始的分生组织中表达较强,并且其启动子转录活力在受到根瘤菌侵染后诱导增强表达;MtROP5的过量表达和组成型激活突变均能显著促进根毛的伸长,相比对照转化根系,根毛长度分别增长了74.6%和54.8%,而通过RNAi干扰降低MtROP5的转录水平后,根毛的生长发育明显受到了抑制,其转化根系的根毛缩短了47.6%,但MtROP5显著性失活突变转化根系的根毛长度与对照转化根系没有显著差异。【结论】蒺藜苜蓿MtROP5调节了根毛的生长发育,并可能参与宿主植物与根瘤菌共生互作早期的信号传导过程。     

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

应用PCR技术从刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2（rh—potryprotein2）的部分基因，构建pGEX—KG—ROP2重组表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定后，将阳性质粒转入E．coli BL21CodonPlus中，在IPTG诱导下表达，表达产物用SDS—PAGE和Western—blot分析鉴定。结果表明，扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9％，该基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000，可被兔抗弓形虫免疫血清识别。     

Expression of ROP/RAC GTPase genes in postharvest loquat fruit in association with senescence and cold regulated lignification

ROP/RAC GTPases regulate various development processes and play important roles in plant defense responses. Recently, lignification or secondary cell wall formation related ROP members were reported in rice, zinnia, cotton and Eucalyptus. The present study aimed to investigate the possible association of loquat ROPs with flesh lignification under different temperatures. Four ROP cDNA fragments, EjROP1.1, EjROP1.2, EjROP2 and EjROP3, were isolated from ‘Luoyangqing’ (LYQ) loquat fruit, and all of them shared over 80% nucleotide identity with known ROPs from other plants. Sequence analysis revealed that EjROP1.1, EjROP2 and EjROP3 might be functional while EjROP1.2, with mutated C-terminal resulted from a 65 bp deletion in the corresponding nucleotide sequence as compared with EjROP1.1, might be dominant-negative and consequently act as a negative regulator of ROP signal transduction. Increase in expression of EjROP1.1, EjROP2 and EjROP3 was observed during first 4 or 6 d of storage at 20 °C and was positively correlated with the increase in flesh firmness. Expression of EjROP1.2 was constantly low under 20 °C but was quickly, within 6 h, induced under 0 °C, and it increased by about 20 times within 24 h. The expression was induced under 5 °C as well but not so strong as that under 0 °C, and transfer of fruit from 5 °C to 0 °C re-stimulated the expression. The possible roles of EjROPs played during senescence and cold regulated lignification was discussed, and the simultaneous increase in the expression of three functional EjROPs and the negative regulator EjROP1.2 was suggested to be important for maintaining a ROP rheostat to protect cells from excessive lignification. To our knowledge, this is the first study on a dominant-negative ROP resulted from a deletion mutation, and a ROP responded to low temperature.     

拟南芥不同ROP蛋白对病原细菌增殖的影响

ROP蛋白是植物特有的一类小G蛋白,在植物信号传导途径中起重要作用.拟南芥共编码11种ROP蛋白,为明确ROP蛋白在拟南芥抗病反应中的作用,将病原细菌Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000接种于各AtROP的激活和失活突变体后,观察其增殖情况.结果表明,AtROP2和AtROP11抑制病原菌的增殖,而AtROP10则促进病原菌的增殖,其他At-ROP对Pst.DC3000的增殖没有影响.     

辣椒CaROPGEF1 cDNA的分离及其结构和表达的初步分析

ROP是植物特有的一类Rho相关GTPases,在植物体内通过GTP结合形式与GDP结合形式的切换而对生长发育和适应环境起调节作用.由GTP结合形式向GDP结合形式的转换主要依赖于鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchangefactor,GEF).本文以锁定于GDP结合形式的辣椒DN-CaROP1突变体为诱饵,采用ProQuestTM酵母双杂交体系,从辣椒幼苗cDNA文库中分离了辣椒GEF阳性克隆,其推导的氨基酸序列与其他植物中发现的GEF具有较高的同源性,并含典型的植物ROPGEF保守域DUF315及N端与C端的高度变化域,将之命名为CaROPGEF1;RT-PCR分析表明,CaROPGEF1在辣椒多种组织中均有表达;进一步酵母双杂交分析表明,CaROPGEF1可与GDP结合态的ROP结合,而不能与GTP结合态的ROP结合.上述结果暗示CaROPGEF1调节的ROP从DN态向CA态的转化在辣椒植株中频繁发生,可能参与辣椒ROP介导的生长、发育和对环境适应的调控.