芸豆凝集素受体在小鼠生殖细胞上的分布及作用研究

[目的]探讨芸豆凝集素（PHA）受体在小鼠精子和卵母细胞上的分布及作用。[方法]应用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的芸豆凝集素作为分子探针,确定其PHA受体在小鼠精子和卵母细胞上的分布。通过不同浓度PHA处理精子和卵母细胞,研究PHA预处理对精子获能和顶体反应,以及对卵母细胞FITC—PHA染色的影响。l结果]PHA受体主要表达于小鼠精子整个尾部区域和顶体反应后的头部质膜,2mg／mlPHA预处理有抑制顶体反应的作用;卵母细胞透明带和细胞膜都有PHA受体的存在。不同浓度PHA处理卵母细胞对其透明带阿FTIC—PHA染色影响不大,但对其细胞膜染色有较大影响,且不同浓度之间差异明显。[结论]芸豆凝集素受体是小鼠精子和卵母细胞受体的重要组成部分,且在精卵质膜融合过程中发挥重要作用。     

Establishment of a Conditional Transgenic System Using the 2A Peptide in the Female Mouse Germline

Transgenic mice are essential research tools in developmental biology studies. The 2A peptide allows multiple genes to be expressed simultaneously at comparable levels in somatic cells, but there are no reports of it being used successfully in germ cells. We constructed a Cre/loxP-based conditional vector containing the 2A peptide to significantly enhance the expression of a reporter and target gene from a constitutive promoter in oocytes. Mice with a transgene insertion containing the chicken β-actin promoter, floxed EGFP-polyA cassette, mCherry reporter, 2A peptide and target gene DNA methyltransferase 3A2 (Dnmt3a2) were crossed with TNAP- or Vasa-Cre mice to produce offspring, in which mCherry and DNMT3A2 proteins were highly expressed in oocytes upon Cre-mediated removal of EGFP-polyA. This novel transgenic mouse line based on the 2A expression system can serve as a useful tool for examining gene function during oogenesis.     

牛生发泡期裸卵体外成熟培养体系的建立

本研究通过牛(Bos taurus)卵母细胞体外成熟培养不同时间(0和10 h),剥除卵母细胞外周的颗粒细胞后继续培养,观察其与不脱颗粒细胞正常体外成熟培养卵母细胞之间的差异.研究结果显示:成熟培养0脱颗粒细胞的卵母细胞,与正常成熟培养的卵母细胞在成熟率(19.51%vs.80.14%,P<0.05)、卵裂率(27.08%vs.82.61%,P<0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(7.69%vs.21.71%,P<0.05)差异显著;成熟培养10 h后脱颗粒细胞的牛卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞相比,在成熟率(82.71%vs.80.14%,P>0.05)、卵裂率(83.01%vs.82.61%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(19.30%vs.21.71%,P>0.05)无显著差异.向成熟培养10h脱颗粒细胞的卵母细胞内注射pVenus-Hlfoo mRNA,pVenus,pDsRed1-N1和重组质粒pDsRedl-Hle都能够得到表达.非功能标记基因显微注射组与对照组在卵母细胞成熟率(81.42%vs.82.03%,P>0.05)、卵裂率(75.24%vs.78.15%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(17.42%vs.18.82%,P>0.05)上差异不显著.研究结果提示:在成熟培养10 h,剥离颗粒细胞不会影响牛卵母细胞的发育潜能,这一技术平台可以用于牛卵母细胞体外成熟分子机制的研究.     

显微注射Ca^2＋激活小鼠M Ⅱ期卵母细胞

胞质内显微注入Ｃａ＾２＋可以激活小鼠Ｍ Ⅱ期卵母细胞，且随着卵龄的增加，激活率明显升高。卵龄小于１６ｈ（ｈＣＧ注射后）注射Ｃａ＾２＋引起的激活率很低，卵龄超过１８ｈ，激活率达到５０％以上。卵龄小于１６ｈ的卵母细胞，卵内注入超纯水未能激活卵母细胞，而在１８￣１９ｈ卵龄组，注射水的对照组激活率为３５％，但显著或极显著地低于注射Ｃａ＾２＋的试验组。激活前注射ＥＤＴＡ卵母细胞的激活率约为３０％，激活后注射     

激素和表皮生长因子对牛卵母细胞体外受精的影响

[目的]研究激素和表皮生长因子(EGF)对牛卵母细胞体外受精的影响。[方法]通过对牛进行体外受精和受精卵体外培养,研究了不同血清、激素及EGF对卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育的影响。[结果]单独添加ECS组卵母细胞的成熟率、卵裂率、桑囊率均最高,分别为81.39%5、6.05%、30.94%,且卵裂率、桑囊率与添加NBS组的差异显著。在培养液中添加EGF和激素能促进卵母细胞的成熟和卵裂的发生,其成熟率、卵裂率分别为82.50%、83.33%和61.43%、62.21%,均比未添加EGF组的高,差异显著,并且EGF与激素间有协同作用。[结论]单独添加10%ECS对卵母细胞的作用最理想,EGF对牛卵母细胞体外成熟及卵裂有良好的促进作用。     

山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集

山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集＊芮荣张涌李裕强（西北农业大学发育生物学研究室，陕西杨陵７１２１００）ＣｏｌｅｃｔｉｏｎｏｆＰｒｅａｎｔｒａｌＦｏｌｉｃｕｌａｒＯｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍＧｏａｔＯｖａｒｉｅｓＲｕｉＲｏｎｇＺｈａｎｇＹｏｎｇＬｉＹｕｑｉａｎ...     

猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养

 主要研究了猪体外成熟卵母细胞电激活的条件以及孤雌激活胚胎的体外培养体系。用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活猪体外成熟的卵母细胞。结果表明 ,在本试验条件下电激活最佳场强和脉冲时程为 130V·mm-1/ 80 μs ,其囊胚发育率为 (2 0 .12± 8.18) % (P >0 .0 5 )。多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好 (P >0 .0 5 )。孤雌激活胚胎用不同培养方式和气体环境在体外培养 7d ,发现 7d不换液与第 5天换液和第 5天换含 10 %胎牛血清的培养液其囊胚发育率 [分别为 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、(2 6 .4 4± 8.35 ) %和 (17.6 8± 5 .39) % ]无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,后两者换液培养方式其囊胚细胞数 (15 .78± 5 .4 6、14 .5 5± 4 .81)明显低于不换液的 (18.0 1± 6 .79,P <0 .0 1)。同时发现低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养的胚胎囊胚发育率和囊胚细胞数和高氧环境 (5 %CO2 的空气 )无明显差别 ,分别为 [(2 0 .78± 8.80 ) %、17.0 0± 6 .12和 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、18.0 1± 6 .79,P >0 .0 5 ]。表明激活后第 5天换原液和换含胎牛血清的培养液不能提高囊胚细胞数。低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养猪胚胎的效果不比高氧环境 (5 %CO2 的空气 )好。     

山羊卵母细胞冷冻保存及其对发育效果的影响

在程序冷冻条件下,冷冻保护剂种类对山羊卵母细胞发育效果有显著影响。对于山羊GV期卵母细胞,解冻后的形态正常率,PROH(83 1%)和DMSO(81 7%)均高于甘油(70 7%)(P<0 05);而体外成熟率则是PROH(20 3%)高于DMSO(14 2%)和甘油(9 8%),DMSO又高于甘油(P<0 05)。对于山羊IVM卵母细胞,解冻后的形态正常率,PROH(84 5%)和DMSO(86 4%)均高于甘油(74 2%)(P<0 05);而受精率则是PROH(23 2%)高于DMSO(17 5%)和甘油(13 1%),DMSO又高于甘油(P<0 05)。冷冻方法和卵母细胞发育阶段对冷冻效果有显著影响。从冷冻方法看,程序冷冻和OPS玻璃化冷冻,GV期卵母细胞的成熟率分别为19 7%、27 6%,受精率为3 3%、8 6%;培养9h卵母细胞的成熟率分别为20 6%、30 9%,受精率为4 4%、10 3%;IVM卵母细胞的受精率分别为20 9%、29 4%,2 细胞率为4 4%、8 8%,均是OPS玻璃化高于程序冷冻,差异显著(P<0 05);从卵母细胞发育阶段看,不论是程序冷冻还是OPS玻璃化冷冻,GV期和培养9h卵母细胞的成熟率、受精率差异均不显著(P>0 05),但受精率均显著低于IVM卵母细胞(P<0 05)。     

OPS法玻璃化冷冻山羊卵母细胞的研究

采用两种不同的冷冻保护液VS Ⅰ(EG DMSO)和VSⅡ(PROH DMSO),用OPS法对不同期的卵母细胞进行冷冻.结果表明,两种冷冻液的冷冻效果差异不显著(P＞0.05),但从数据看,VS Ⅰ要优于VSⅡ;而不同期的卵母细胞对于冷冻后的发育能力有明显的影响,无论是VS Ⅰ还是VSⅡ,GV期和培养10h卵母细胞的形态正常率、成熟率、受精率差异不显著(P＞0.05),但GV期和培养10 h卵母细胞受精率均低于ⅣM期卵母细胞,它们之间差异显著(P＜0.05).     

来源和质量不同对山羊卵母细胞体外成熟率的影响

比较了卵母细胞级别对体外成熟率的影响,以及促卵泡素(FSH)处理山羊对卵母细胞采集的数量和质量的影响。结果表明:卵母细胞级别对体外成熟率有显著影响,不论是来源于FSH处理卵巢还是屠宰场卵巢,均是A、B级卵母细胞的成熟率高于C级卵母细胞,差异极显著(P<0.01)。但是A、B级卵母细胞之间差异不显著;卵巢来源对卵母细胞采集的数量和质量有显著影响,A、B级卵母细胞在获卵总数中所占的比例,平均每个卵巢获卵母细胞数及A、B级卵母细胞数,均是FSH处理卵巢高于屠宰场卵巢,差异显著(P<0.05);卵巢来源对卵母细胞体外成熟率有显著影响,来自于FSH处理卵巢的卵母细胞体外成熟率高于屠宰场卵巢(81.6%比67.6%),差异极显著(P<0.01)。