表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

 【目的】重组新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒（very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV）及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21 d分别以vvIBDV Gx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV－VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120 h,脑内致病指数（ICPI）分别为0.4和0.36,静脉内致病指数（IVPI）均为0;接种后72～96 h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0 EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100％保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90％以上。 【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。     

CpG ODN对鸡新城疫LaSota活疫苗的免疫增强效应

将3种不同的未甲基化CpGODN分别与新城疫LaSota活疫苗混合后，经滴鼻和点眼免疫鸡，通过检测鸡血清中HI抗体、外周血T淋巴细胞增殖活性、诱导巨噬细胞分泌NO含量，以及刺激外周血淋巴细胞表达IFN-γ、IL-6与IL-1β mRNA量，分析各CpGODN对新城疫LaSota活疫苗免疫效果的影响。结果表明，经2次免疫后，含GTCGTT核心基序的CpG ODN1组，鸡血清平均HI抗体效价最高达8．2log2、淋巴细胞刺激指数达9．836、NO分泌量达35．833μmol／L，分别比疫苗单独免疫组高出2个滴度（P〈0．05）、4．4（P〈0．01）、27．6μmol／L（P〈0．01）；含GACGTT核心基序的CpG ODN2组增强作用不明显．与疫苗单独免疫组无差异；而CpGODN3的免疫刺激活性由于受其侧翼序列的影响，作用明显减弱甚至丧失。对细胞因子的影响，CpGODN3组IFN-γ mRNA表达量稍高于CpG ODN1组，而其余细胞因子均以CpG ODN1组表达水平最高（P〈0．05）。由此证明CpG ODN1能显著增强鸡对新城疫LaSota活疫苗的体液和细胞免疫反应，可以作为高效的免疫增强剂。     

猪脾转移因子提高LaSota株鸡新城疫弱毒疫苗的免疫保护率

旨在了解猪脾转移因子（TF）对新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗LaSota株的免疫增强效果及机制。本研究分别采用不同剂量（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5羽份） LaSota疫苗株单独（单独免疫组）、LaSota疫苗株与TF联合（联合免疫组）免疫SPF鸡,14 d后以NDV F₄₈E₉强毒攻毒,同时设立对照组（非免疫攻毒）和空白组（非免疫非攻毒）,并采用ELISA方法与蛋白质芯片技术分别测定外周血IL-4、IFN-γ与IL-12 P40浓度。结果显示,鸡免疫10^-2、10^-3、10^-4、10^-5羽份时疫苗攻毒保护率和半数保护量（PD₅₀）如下：单独免疫组分别为100%、55%、0%、0%和0.000 8羽份,联合免疫组分别为100%、75%、0%、0%和0.000 5羽份,对照组和空白组死亡率分别为100%和0%。免疫10^-3羽份疫苗后,联合免疫组IL-4和IFN-γ含量均高于其他组,并于第7、14天差异极显著（P<0.01）;攻毒后,联合免疫组IL-4、IFN-γ和IL-12 P40含量均高于其他组,IL-4于第1、14天,IFN-γ于第1、3天,IL-12 P40于第1天差异极显著（P<0.01）。综上表明,TF可增强IFN-γ、IL-12介导的细胞免疫和IL-4介导的体液免疫,提高LaSota株弱毒疫苗的免疫保护率,降低疫苗PD₅₀;在抵抗NDV F₄₈E₉强毒攻击时,联合免疫组的免疫保护率明显高于单独免疫组。     

新鱼腥草素钠增强NDV LaSota疫苗免疫作用研究

用新城疫病毒(NDV) LaSota株弱毒活疫苗接种1日龄非免疫健康肉雏鸡的同时,以新鱼腥草素钠为免疫佐剂按不同剂量颈部皮下注射,以生理盐水为对照;二次免疫后第7、14、21、28天分别测定各组动物的抗NDV血凝抑制抗体和外周血CD4 /CD8 淋巴细胞比值.结果表明: 新鱼腥草素钠对提高鸡体抗NDV血凝抑制抗体效价和外周血CD4 /CD8 淋巴细胞比值都有一定作用,与对照组差异显著(P<0.05),且这种作用与给药剂量有关.另外,新鱼腥草素钠对细胞免疫的影响早于对体液免疫.     

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

低血凝价新城疫LaSota株病毒免疫原性的研究

用血凝价分别为0、7、8的三批新城疫LaSota株病毒制备的油乳剂疫苗免疫60日龄蛋鸡,疫苗免疫10d后HI抗体水平平均值分别为3.9Log2、5.2Log2、5.9Log2,免疫后20dHI抗体水平升到高峰(4.0Log2、8.1Log2、7.9Log2),免疫60d后用剂量为100ELD50的同种毒攻击。结果表明,血凝价为0的新城疫LaSota株病毒抗原制备的油乳剂免疫效果较差,不能抵御病毒的攻击,但血凝价为7和8的两批病毒抗原能抵御病毒的攻击,并与血凝价为9的病毒抗原的免疫原性无显著差异。     

免疫不同的IBD中等毒力活疫苗对ND(LaSota)疫苗体液免疫应答影响

维扬麻鸡150只分为5组(即Ⅰ-Ⅴ组).其中I、Ⅱ、Ⅲ组为试验组,对应用市售的A、B、C三种lBD中等毒力活疫苗进行两次免疫接种,Ⅳ组为ND免疫对照组,Ⅴ组为空白对照组,在IBD活疫苗二免后定期监测鸡群免疫ND(LaSota)疫苗后的HI抗体消长情况,以评价这3种IBD活疫苗对NDHI抗体产生的影响程度。结果发现,I组(免疫A疫苗)对NDV的HI抗体水平的影响最大,Ⅱ组(免疫B疫苗)对NDV的HI抗体水平的影响次之,Ⅲ组(免疫C疫苗)对NDV HI抗体水平的影响轻微。     

H5亚型血凝素基因的插入对重组LaSota毒株在组织中病毒分布的影响

为了研究外源基因H5亚型血凝素基因插入到NDV后对重组LaSota毒株在组织中对NDV病毒分布的影响,用构建的rL-F（M）-FHA和rL-FHA与亲本毒株重组LaSota野毒株（rLaSota）经滴鼻、点眼免疫SPF雏鸡,分别在免疫后1 d、3 d、5 d、10 d、15 d和18d后采集病料（气管、肝脏,肺脏、肾脏、大脑、脾脏、腺胃、十二指肠）,利用免疫组化染色方法检测病毒在机体内的分布。H5亚型血凝素基因的插入对NDV病毒分布、病毒在组织中出现时间有很大影响,而F基因突变株的变化也是影响病毒分布、病毒在组织中出现时间的主要因素。     

LaSota vaccination may not protect against the lesions of velogenic newcastle disease in chickens

Two groups of six weeks old cockerels comprising 40 immunized and 40 non-immunized birds were inoculated intramuscularly with VGF-1, which is a local Nigerian strain of velogenic Newcastle disease virus (VNDV). Immunized birds did not show any clinical signs except significant loss (p < 0.05) in body weight on days 5 and 20 post inoculation (PI). But the non-immunized birds showed clinical signs of disease characterized by anorexia and drowsiness from day 2 PI. These were followed on day 3 PI by depression, diarrhoea, opisthotonus, weight loss (p < 0.05) and high mortalities (96.9%). Both the immunized and non-immunized groups showed severe atrophy of the bursa, spleen and thymus. Histopathological section of these lymphoid organs showed necrosis and depletion of lymphocytes. Both the gross and microscopic lesions were more severe in the non-immunized birds. Marked ballooning degeneration was observed in the bursal follicles of the non-immunized birds. This lesion has not been described earlier for any other disease and could be diagnostic for VND. Our results also showed that VND can cause marked atrophy of the lymphoid organs, which may lead to immunosupression without the characteristic signs of Newcastle disease (ND) in vaccinated chickens. This no doubt emphasizes the limitation of vaccination as a biosecurity measure in poultry industry. Ezema, W.S., J.O.A. Okoye and Nwanta, J.A., 2008. LaSota vaccination may not protect against the lesions of velogenic Newcastle disease in chickens. Tropical Animal Health and Production