柔嫩艾美耳球虫感染鸡盲肠和脾脏一氧化氮合酶的表达

采用NADPH—d(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate—diaphroase)组织化学法观察了雏鸡感染柔嫩艾美耳珠虫(E．tenella)后一氧化氮合酶(N0S)在盲肠和脾脏中的分布与表达情况。试验结果表明，所有正常鸡盲肠粘膜下层和肌层均有较深的着色，根据以往的资料和N0S的表达特性初步判断为神经元型N0S(nNOS)；试验鸡在感染后3～5d，盲肠粘膜上皮和肠腺上皮也有较深的着色，并从感染后7d开始着色减弱；而对照组鸡盲肠粘膜上皮和肠腺上皮以及对照组和试验组的脾脏几乎不着色或着色很浅。试验结果提示，盲肠粘膜上皮和肠腺上皮的着色可能是诱导型N0S(iN0S)表达的结果，而由其产生的N0参与雏鸡球虫感染过程。     

黄艾美球虫侵犯宿主组织的超微研究

利用透射电镜和扫描电镜相结合的技术对黄艾美球虫（E.flavescens）人工感染后的子孢子移动过程及被虫体寄生的宿主细胞形态学变化和粘膜形态学变化进行了观察。子孢子在进入小肠腺上皮过程中需白细胞介导，在白细胞内可发育成球形的滋养体，观察到有两个子孢子侵入同一白细胞的现象，但分别存在于各自的带虫空泡中，黄艾美球虫引起的肠粘膜损伤主要发生于感染177小时之后，其损伤主要表现在绒毛大片脱落，结缔组织裸露，表面可见到大量破损的孔洞及大量肠杆菌，被虫体寄生的腺上皮细胞基部膨胀，微绒毛脱落，细胞核膨大并部分包被虫体，有些细胞核裂解为二。     

巨型艾美耳球虫偏菱形样蛋白EmRP免疫原性分析

在前期研究中,从巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)cDNA文库中筛选到了免疫保护性抗原偏菱形样蛋白EmRP,本研究为揭示该抗原的免疫保护机理,进一步检测了其免疫原性。以E.maxima卵囊cDNA为模板,用RT-PCR技术扩增EmRP,并构建真核表达质粒pVAX1-EmRP,将其经腿部肌肉注射2周龄的雏鸡,3周龄加强免疫。分别于首次免疫后和加强免疫后1周,采集血清,用ELISA方法检测血清特异性IgG水平,用荧光定量PCR方法(qPCR)检测细胞因子水平,用流式细胞术检测CD4^+T淋巴细胞和CD8^+T淋巴细胞的比例,分析EmRP诱导的免疫反应。序列分析表明,EmRP含有偏菱形样蛋白超家族成员保守区域,为非跨膜蛋白,分子量约为28.4 kD。真核表达质粒pVAX1-EmRP免疫鸡后,与对照组相比,鸡体IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17等细胞因子转录水平显著提升;CD8^+和CD4^+ T细胞比例显著提高,而血清特异性IgG水平与对照组差异不显著。结果表明,EmRP诱导的免疫保护作用主要是由其诱导的细胞免疫反应实现的,可以作为研制E.maxima新型疫苗的候选抗原。     

藏鸡和隐性白羽鸡感染柔嫩艾美耳球虫后免疫相关基因的表达变化分析

试验旨在从免疫遗传学的角度初步探讨藏鸡（TC）和隐性白羽鸡（RWC）对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）易感性差异的分子机制,分别用1×10⁵个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染对球虫具有抗性的藏鸡和易感的隐性白羽鸡。应用实时荧光定量PCR检测藏鸡和隐性白羽鸡感染前0 d和感染后第2、4、6和8天脾脏、盲肠、胸腺、法氏囊中γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-16、Toll样受体（TLR3）和TLR15免疫相关基因的转录水平变化。结果显示,藏鸡脾脏IFN-γ、IL-2、IL-16及TLR3、TLR15免疫相关基因转录水平于感染后第4和8天明显上调,隐性白羽鸡则无明显变化。藏鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第2天显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第4天起显著上调（P<0.05）,其余免疫相关基因变化幅度不大;隐性白羽鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第8天显著上调（P<0.05）,IL-2在感染后第2天起显著上调（P<0.05）,IL-16在感染后第6天起显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第2和8天显著上调（P<0.05）,TLR15变化幅度不大。各免疫相关基因在2个品种鸡胸腺和法氏囊中均出现上调或下调,但除藏鸡法氏囊TLR3和TLR15转录水平变化幅度相对较大外,其余免疫相关基因与感染前相比变化幅度不大。以上结果显示,球虫感染主要导致藏鸡和隐性白羽鸡脾脏和盲肠中的各免疫相关基因出现显著变化,表明宿主的遗传背景在一定程度上可影响球虫感染的免疫应答。     

假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液指标的影响

本试验旨在研究假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液指标的影响。270只1日龄海南文昌公鸡,随机分为6个组,每组3个重复,每重复15只,T1、T2和T3组为对照组(依次分为不感染不给药组、感染不给药组、感染给药组);T4、T5和T6组为假蒟添加组,分别在基础日粮中添加200、400、600mg/kg假蒟提取物粉剂。15日龄时,每组随机抽取30只鸡,除T1组灌服生理盐水外,其他各组鸡均经口接种柔嫩艾美耳球虫卵囊悬液,分别于接种前1d,接种后3、6、9d清晨采血测定其血液指标。结果表明,与感染球虫不给药的T2组相比,假蒟组(T4、T5、T6)可以显著降低感染球虫鸡粪便中球虫卵囊值(P0.05)。假蒟组在感染球虫后第6天,与T1组比,RBC、HGB、HCT、Ca2+、Na+、Cl-、TP、ALB、GLB、TG、CHOL、T4等指标呈下降趋势;但在感染球虫后第9天,TP、GLB含量均显著高于T1组(P0.05);在感染球虫后第6天,假蒟组与对照组相比,ALT、AST浓度水平均显著降低(P0.05)。结果提示,假蒟提取物能提高感染球虫后鸡机体免疫机能,降低肝脏损伤,降低鸡感染球虫后粪便卵囊值,具有一定的抗球虫效果。     

家兔感染黄艾美耳球虫的病理学变化及卵囊形成的观察

用２０００个孢子化的黄艾美耳球虫卵囊灌胃感染无球虫兔，２４０ｈ手术后取肠道样品，制片，光镜观察，结果表明，黄艾美耳球虫为家兔的强致病种，感染后盲肠的组织病理学变化最严重；盲肠基部是卵囊形成的主要部位．圆小囊，蚓突，结肠是卵囊形成的次要部位。     

鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术的构建及致病性研究

构建了一种新的鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术 ,并对杨陵柔嫩艾美耳球虫地理株进行了分离 ,对继代增殖的纯种卵囊进行了致病性试验。结果表明 ,该单卵囊分离技术简单易行 ,单卵囊感染成功率可达4 0 % ;该虫株对雏鸡有很强的致病性 ,经口接种 1× 10 5个孢子化卵囊 ,致死率高达 80 %。     

禽类艾美耳球虫生物学和免疫生物学的研究进展

[目的]介绍禽类艾美耳球虫生物学和免疫生物学的研究进展,减少其对养禽业造成的经济损失。[方法]从禽类球虫的生活史、遗传学、生物化学、种类鉴定和诊断、免疫生物学、球虫病的控制及未来发展方向和亟待解决的问题等方面,阐述了近年来的发展情况。[结果]禽类的艾美耳球虫的生活史包括有性生殖阶段和无性生殖阶段;球虫的生物学发育也比较清楚;在外界环境中进行孢子生殖;目前其种类主要为7类;在球虫感染的免疫学方面研究有很大进展;在了解以上生物学和免疫生物学的研究进展后,提出了防治措施。[结论]该研究为防治养禽业球虫病提供了依据。     

柔嫩艾美耳球虫MIC4-N的真核表达

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫的MIC4-N端基因并去掉信号肽,为了表达检测和纯化的方便,设计引物时改变了3＇端的终止密码子,使MIC4-N的C末端带有c-myc和6His抗原标签。通过双酶切,使加工好的MIC4-N基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,转化JM109感受态细胞。再经EcoRⅠ与NotⅠ双酶切、菌落PCR及测序鉴定,证明目的基因与真核表达载体pPICZαA构建成功,单酶切重组表达载体、电转转入GS115酵母感受态细胞中。用含高浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母菌落,菌落PCR法鉴定转化成功的阳性菌,在BMMY培养基中摇瓶培养,并用甲醇诱导,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,蛋白分泌表达成功。     

鸡堆型艾美尔球虫3-1E抗原表位的生物信息学预测

应用生物信息学分析和预测鸡堆型艾美尔球虫3-1E蛋白二级结构和抗原表位,为确定和筛选优势表位,研制安全、高效表位疫苗奠定基础。以克隆获得的鸡堆型艾美尔球虫3-1E蛋白氨基酸一级结构为基础,采用DNAStar软件和生物信息学在线分析程序Prot Param、SOSUI、IEDB、SYFPEITHI等预测3-1E蛋白理化性质和二级结构,并分析其序列跨膜区、可溶性、亲水性、可及性、柔韧性参数以及抗原指数,预测B细胞表位和T细胞表位的可能区域。3-1E蛋白由170个氨基酸组成,分子式C818H1257N213O272S3,分子质量18.5234 ku,理论等电点为4.25,半衰期为10 h;无跨膜区均为膜外区,是一种可溶性蛋白。其二级结构中α螺旋占31.76%,β转角为12.35%。B细胞表位预测区域:44-49、65-67、86-87、111-116;分值较高的T细胞表位区域:52-60、94-102、97-105、154-162、157-165。运用生物信息学方法确定3-1E存在多个抗原表位,对进一步研究3-1E的抗原性和研发优势表位疫苗具有重要意义。