基于转录组测序的半滑舌鳎长链非编码RNA的初步鉴定与分析

以抗病家系与易感家系半滑舌鳎为材料,进行哈维弧菌感染实验,并对易感家系感染前(CsSU)、易感家系感染后(CsSC)、抗病家系感染前(CsRU)、抗病家系感染后(CsRC)4组进行转录组测序,根据RNA-seq数据挖掘半滑舌鳎长链非编码RNA信息;通过生物信息学分析,筛选出与抗哈维弧菌病相关的差异长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。结果显示,共识别出4 584个lncRNA座位,包含5 714个转录本;其基本特征与编码基因的比较分析,lncRNA的GC含量低于编码基因,单外显子基因数多于编码基因,转录本的平均长度长于编码基因,基因表达量低于编码基因。对4组样品进行两两比较(CsRU vs CsSU、CsRC vs CsSC、CsRC vs CsRU、CsSC vs CsSU)分别筛选出818、813、261、140个差异表达lncRNA,其中CsRU与CsSU之间、CsRC与CsSC之间lncRNA数目差异最多,通过聚类分析确定了各实验组的表达模式之间的联系,CsRU与CsSU之间的表达模式最为相近。通过共表达分析,预测出lncRNA和274个编码基因可能存在14 539种相互关系,并进行了功能注释,进而筛选出7个关键lncRNA。qRT-PCR结果显示,差异表达lncRNAs的表达模式和转录组数据得到的基本一致。研究结果为揭示lncRNA在半滑舌鳎抗哈维弧菌免疫调控反应中的作用提供重要的参考数据。     

半滑舌鳎耗氧率和窒息点的初步研究

对半滑舌鳎的耗氧率和窒息点进行了初步研究。结果表明,在各个盐度梯度下,半滑舌鳎的耗氧量和耗氧率与体重(W)之间的关系可用幂函数Q=aWb表示,其中,耗氧量与体重呈正相关,耗氧率与体重呈负相关,方差分析表明,盐度和体重对半滑舌鳎的耗氧量和耗氧率均有极显著的影响(P<0 01);不同规格半滑舌鳎耗氧率的最高值均出现在同一盐度组,最低值则因体重不同而出现在不同的盐度组。半滑舌鳎的耗氧率无较明显的昼夜变化,夜里的耗氧率略大于白天,昼夜两阶段耗氧率的差异不显著。窒息点随着温度和体重的增加而有所增加,在较低的温度下,半滑舌鳎有很强的耐低氧能力。     

渤海半滑舌鳎人工育苗工艺技术的研究

对渤海半滑舌鳎人工育苗的水温、盐度、饵料等培育条件与种苗发育、生长及成活率的关系进行了试验,建立了人工育苗工艺流程。结果表明半滑舌鳎受精卵在不同水温范围内的孵化率有明显差别。种苗培育分前期、后期和幼鱼期3个阶段。前期鱼苗成活率为12.9％;后期为66.0％;幼鱼期为100％。饵料种类为轮虫、挠足类和卤虫,开口饵料为轮虫。1987年2次分别育出仔鱼4.8万尾和0.6万尾;1989年育出仔鱼3.13万尾,45天内培育出完全变态的鱼苗3080尾。种苗培育80天,体长达30.0mm,外形与成鱼完全相同,达到放流规格。     

半滑舌鳎vasa调控区的克隆、表达载体构建及其驱动活性检测

为研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vasa(Csvasa)基因调控区的功能,在已克隆的Csvasa基因编码序列的基础上,采用基因组步移和PCR扩增的方法克隆得到Csvasa调控区,通过生物信息学方法分析vasa基因5′区,并构建了含Csvasa基因调控区的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(p Csvasa-GFP-T),进一步通过显微注射技术初步验证调控区的驱动活性。结果表明,通过基因组步移和PCR扩增获得Csvasa 5′区5 166 bp和3′区1 655 bp,利用在线生物信息学软件对5′区序列进行分析,发现在转录起始点上游26 bp处存在保守的TATA框,以及潜在的转录因子结合点如SRY、Oct-1、Sox-5、CREB、GATA、AP-1、C/EBP、Sp-1、c-Myc、HNF、NKX2-5、V-Myb等。通过显微注射技术,将所构建的p Csvasa-GFP-T表达载体注射于青鳉(Oryzias latipes)受精卵并进行培养观测,发现Csvasa调控区能够驱动GFP在青鳉胚胎内表达,荧光表达率为81%。将有荧光的胚胎培养为成鱼,检测外源基因的整合率为11.5%。这些结果为进一步研究半滑舌鳎原始生殖细胞(PGCs)的标记、追踪和操作研究以及半滑舌鳎的性别控制等奠定了基础。     

河北沿海焦氏舌鳎资源现状分析

焦氏舌鳎过去利用价值较低,但随着渔业捕捞能力的增强,渔业资源衰退的问题日益突出,焦氏舌鳎的生态优势逐步显现。通过对河北省沿岸焦氏舌鳎近年资源状况进行研究,发现近两年其生态优势度有所提升,群体组成存在小型化、低龄化的特点,就此提出了渔业资源养护相关建议。     

半滑舌鳎创伤弧菌分离鉴定及其荧光定量PCR方法的建立

为确定患病半滑舌鳎的病原,从其体内分离到3株革兰氏阴性菌,将其分别命名为ST-1、ST-3和ST-6,进行细菌理化特性、药敏试验、16S rDNA测序以及组织病理学观察等方面的研究,并建立了外膜蛋白(OMP)基因的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,3株分离菌株的理化特性符合创伤弧菌特征,16S rDNA与创伤弧菌标准菌株ATCC29307序列相似性达99%以上,系统发育树分析显示,3株分离株与创伤弧菌自然聚为一支,最终鉴定为创伤弧菌;药敏试验显示,3株菌对头孢克肟、头孢哌酮、链霉素、亚胺培南和氟苯尼考等药物高度敏感。人工回归感染试验表明,分离株具有致病性,且半滑舌鳎、斑马鱼的临床症状与自然患病鱼症状相似;组织病理学观察显示,鳃丝上皮细胞增生,鳃小片肿胀黏连、颗粒细胞和黏液细胞增多,肝脏中央静脉淤血,肾脏出血、坏死,肠道黏膜固有层萎缩、黏液细胞增多等。进一步建立OMP基因的荧光定量PCR方法,结果显示,标准曲线的相关系数为0.995,检测下限为1.88×10~2 CFU/mL。以上结果可为半滑舌鳎弧菌病的致病机理、分子诊断和防治提供科学参考。     

几种重金属离子对半滑舌鳎组织损伤的研究

实验室条件下,1龄半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisG櫣nther)暴露在浓度为0·1×10-6mg/L的Pb~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)、Cu~(2+)溶液中。随暴露时间的延长,半滑舌鳎的行为发生一定的变化:Cd~(2+)、Cu~(2+)组的鱼行动缓慢,应激性很差,偶尔还出现不协调的颤抖性游泳行为,试验结束时几乎不摄食;Pb~(2+)和Zn~(2+)组的鱼游动积极,与实验前无大差别。利用常规组织切片法检查Pb~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)、Cu~(2+)对半滑舌鳎鳃、肝脏、肾脏、脾脏、脑的组织损伤情况。结果显示,Cd~(2+)、Cu~(2+)对鳃、肝脏和肾脏的损伤最为严重,引起了次鳃小瓣结构的崩溃;肝脏细胞脂肪颗粒的变形和大量堆积,造血组织坏死;肾小球结构溃解和管细胞肥大。Pb~(2+)、Zn~(2+)组鱼次鳃小瓣基部上皮呈空泡状,粘液细胞数量减少,氯细胞肥大增生;肝脏脂肪颗粒堆积,肝细胞肥大增生;肾脏血细胞坏死,肾小管形态溃解和管细胞增生。对脾脏和脑的损伤未观察到。将行为学变化和生理损伤结合可以对在人工养殖过程中重金属的污染及早提出预警。     

半滑舌鳎溃疡病原杀鲑气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)是广受我国消费者认可的名优鱼类,具有很高的营养价值和经济价值,然而,随着工厂化养殖模式的不断发展,疾病成为制约半滑舌鳎养殖业健康发展的关键因素,其中,体表溃疡病为其常见病症。从严重溃疡病半滑舌鳎体内分离到1株优势菌株HX0416,该菌可在TCBS培养基上生长,并可在绵羊血平板上形成清晰的β-溶血环;经过16S rRNA和rpo D基因序列同源性分析并结合生化特性鉴定为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。健康半滑舌鳎幼鱼感染试验表明,该菌对半滑舌鳎具有较强致病性,感染72 h(1.04×106cfu·m L-1)对攻毒鱼的致死率达91.7%。药敏试验结果显示,该菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等喹诺酮类和头孢曲松、头孢吡肟等头孢菌素类药物比较敏感,而对硫酸新霉素、土霉素等氨基糖苷类和四环素类药物多重耐药,尤其是对磺胺甲噁唑、氨苄西林等磺胺类和β-内酰胺类药物严重耐药。     

黄、渤海半滑舌鳎种群遗传结构的同工酶分析

采用水平淀粉凝胶电泳技术检测黄海、渤海半滑舌鳎两个群体的同工酶组织特异性并分析和研究其群体遗传结构。结果表明,半滑舌鳎的眼、鳃、肌肉、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、鳍条、脑等9种组织和器官对18种同工酶的表达呈现明显的组织特异性。对肌肉和肝脏两种组织的PGDH、MPI、IDHP、SOD、AAT、MDH、LDH、G3PDH、PGM、LAP、ADH、SDH和ALP共13种同工酶进行了遗传学分析,共记录16个基因座位。其中,黄海群体在4个基因位点(IDHP、PGM、G3PDH、SDH)、渤海群体在5个基因位点(IDHP、PGM、MDH2、SDH、ALP)表现为多态,黄海和渤海群体的多态位点比例分别为0.2500和0.3125;两个群体的平均观测杂合度分别为0.0143、0.0104,平均预期杂合度分别为0.0140、0.0102;平均有效等位基因数则分别为1.0151和1.0108。两群体间的遗传距离为0.00012。半滑舌鳎的两个群体遗传多样性水平较低,两群体间无明显的遗传分化。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。