BHK21悬浮细胞在2～8 ℃下短期保存的研究

用密度为5×106个/mL左右的BHK21悬浮细胞为实验原料,在2～8℃条件下静置保存,分别在24、48、72、96 h取样并计数,绘制细胞密度和细胞活力的曲线图,并进行统计学分析.在整个试验培养阶段细胞保持良好状态,趋势线呈平行直线,细胞密度和细胞活力均没有下降.说明BHK21悬浮细胞在2～8℃条件下,在96 h内短期保存时,细胞未出现活力降低或死亡的现象.     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

BHK21细胞的悬浮驯化及其悬浮培养参数研究

[目的]探讨各种悬浮培养条件对BHK-21细胞悬浮培养的影响,尤其是细胞生长过程中出现的细胞结团现象对细胞生长状态的影响,从而摸索出稳定的培养条件。[方法]将BHK-21细胞株进行悬浮驯化培养,通过对悬浮培养的培养液、pH、溶解氧、罐压、搅拌等各种细胞相关生长条件进行研究。[结果]细胞的结团严重影响了细胞的生长代谢。最佳培养条件为最佳接种浓度0.2×106个/ml,牛血清的最佳含量为5%,BHK21细胞培养液理想pH为7.0~7.2,采用2孔通气的100 r/min有利于BHK21细胞的生长。[结论]为体外规模化细胞培养平台奠定理论基础。     

猪白介素18基因在BHK细胞中的表达

将猪白介素18(Porcine interleukin18,PIL-18)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建了重组表达质粒pEGFP-PIL-18,利用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR检测技术确定目的蛋白的表达情况.结果在转染重组质粒24 h4、8 h后的BHK细胞中均观察到绿色荧光,转染的BHK细胞经G418筛选14 d后,用RT-PCR法检测目的基因,并扩增到长576 bpd的目的cDNA片段。表明在BHK细胞中成功地表达了PIL-18与EGFP的融合蛋白,这为下一步建立稳定表达PIL-18的细胞系奠定了基础.     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在BHK21细胞中的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞,ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别是５２．８μｇ／Ｌ和７０．４μｇ／Ｌ。     

冷藏保存BHK21细胞悬液及复苏试验

采用方瓶存放BHK21细胞悬液,在2℃～8℃冰箱存放不同时间后,按常规方法进行细胞复苏和传代。对比存放不同时间后细胞复苏时的驯化次数、细胞数量和细胞活力,寻求最佳存放时间和复苏代次以指导生产。同时将2℃～8℃冷藏保存方法与液氮冻存细胞方法在细胞复苏周期和达到所需扩繁细胞数方面进行比较。结果表明,方瓶冷藏保存BHK21细胞悬液最长可存放60d,经2—5代驯化后,细胞形态和活力恢复正常,细胞数量与收悬液前细胞数量无显著差异,并能稳定传20代以上。与液氮冻存细胞方法相比,该方法在快速恢复细胞产量时有较大优势,在生产周期紧张的情况下可作为辅助方法保障细胞传代的延续。     

不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

[目的]验证成年牛血清在细胞培养过程中对细胞的促生长作用。[方法]分别以商品胎牛血清、新生牛血清、处理的成年牛血清进行悬浮培养BHK21细胞,通过细胞密度、细胞活力等指标来检测各血清对细胞的促生长作用。[结果]3种血清对细胞的促生长作用差异不明显,都具有良好的促细胞生长作用。[结论]处理的成年牛血清具有良好的促细胞生长作用,与胎牛血清、新生牛血清促细胞生长作用差异不明显。     

低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

[目的]对一种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养,并分析该细胞染色体的变异稳定性,以判定其质量。[方法]采用直接法制备4个代次BHK21细胞的染色体标本,用常规Giemsa染色,在1 000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目,并进行核型分析。[结果]BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系,亚二倍体总数为42,亚四倍体细胞总数为72~74,该细胞系染色体的畸变率在各代次所占比例为0~2%,均较低。[结论]该细胞系的遗传学特性相对稳定,各代次间无本质差异,可候选为制苗用细胞。     

Immunogenicity of foot-and-mouth disease virus type O1 replicated in either monolayer or suspended BHK cell system

The efficacy of vaccines formulated from the 10th passage of foot-and-mouth disease virus (FMDV) type O1 in monolayer baby hamster kidney (BHK) cells and the 8th passage in suspension BHK cells was compared in steers. The vaccines were inactivated with ethylenimine, contained an equal amount of antigen and were emulsified in oil-adjuvant. Six animals were vaccinated with each vaccine. During the challenge of immunity (91 days post-vaccination, DPV), one out of the six steers from the monolayer vaccine group became infected with the challenge virus while none of the six steers from the suspension vaccine group contracted the disease during the test period. The neutralizing antibody titers (means) of the serum samples taken at different DPV also did not suggest significant variation between these vaccines. In addition exposure to FMDV infected animals demonstrated that both vaccines elicited an immune state in the vaccinates.     

Development and characterization of stable cell lines constitutively expressing the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein

Despite global efforts to control porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection, the virus continues to cause economic problems in the swine industry worldwide. In this study, we attempted to generate and characterize a panel of stable BHK cell lines that constitutively express the nucleocapsid (N) protein of type 1 or type 2 PRRSV. The established BHK cell lines were found to react well with N-specific antibodies as well as the hyperimmune serum of pigs raised against each genotype of PRRSV. Taken together, the data implicate a potential usefulness for the newly generated stable cell lines as a diagnostic reagent for PRRSV serology.