逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

重组逆转录病毒载体的包装

将3.7kb的LacZ基因片段克隆到含标志基因Neo的逆转录病毒载体，pLXSN与pLNCX的多克隆位点，构建了含有LacZ基因的重组逆转录病毒载体pLLSN和pLNCL.在测定了G418对饥装细胞系PA317的最小致剂量后（最小致死剂量为0.3g/L），通过脂质体Lipofectin与磷酸钙2种介质，分别将2种重组逆转录病毒载体导入包装细胞系PA317进行包装，并以0.3g/L，的G418进行筛选，得到多个G418抗性克隆，经扩大培养，传代，分别得到包装pLLSN与pLNCL的2株阳性细胞，电镜下可见阳性细胞的培养上清中具有逆转录病毒形态特征的成熟病毒粒子，本0研究为运用逆转录病毒载体系统，解决转角因效率低的问题奠定了基础。     

重组逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转移与哺乳动物细胞表达

以构建的重组肿瘤坏死因子逆转录病毒载体ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ转染Ｃｏｓ７细胞，获得了ＴＮＦα暂时性表达。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法，将ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ导入了单向性逆转录病毒包装细胞ψ２，在Ｇ４１８选择下，克隆出了ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞系。该细胞可产生重组ＴＮＦ逆转录病毒。本研究利用ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞分泌的重组逆转录病毒连续传代感染ψ２或ＰＡ３１７细胞以及病毒交替感染ψ２和ＰＡ３１７细胞，     

牛Oct4基因克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

为了克隆奶牛Oct4基因开放性阅读框全序列,并建立高效、稳定产生逆转录病毒质粒pMSCV-Oct4的包装细胞株.我们以50～60日龄的胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR的方法扩增出牛Oct4基因全序列,全长为1 083 bp与GenBank公布的序列的同源性为99.4%.将其插入到逆转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点,获得重组逆转录病毒质粒pMSCVneo-Oct4.鉴定正确后,通过Lipofectamine2000将其转导入包装细胞PT67,用含有G418的培养液进行抗性筛选,获得阳性细胞克隆.细胞上清经过RT-PCR、透射电镜及病毒滴度测定等方法鉴定,证实所包装病毒存在,其滴度值为8.83×107 cfu/mL.试验结果表明我们已获得携带牛Oct4基因的高滴度感染性逆转录病毒.     

含LacZ重组逆转录病毒的制备及其在NIH3T3细胞的表达

构建了含有3．7kbLacZ的重组逆转录病毒载体,转染包装细胞系PA317后,经G418筛选,得到了G418的抗性的产毒细胞系,用收获的含有重组逆转录病毒粒子的浓缩病毒上清,感染NIH3T3细胞。经X-gal染色检测,发现表达了LacZ的NIH3T3细胞呈蓝色。     

异种移植的现状与未来

应用猪的细胞、组织或器官移植治疗人类疾病的研究方兴未艾.本文综述了异种移植的最新进展,侧重阐明了异种移植存在的生理学和免疫学障碍及解决异种移植排斥的策略.讨论了应用猪作为供体进行异种移植可能存在的一些潜在危险性,特别是猪内源性逆转录病毒造成的一系列问题.     

不同逆转录载体系统应用于水牛胎儿成纤维细胞转基因的探索

采用2种不同的逆转录病毒载体系统（pMX和pMSCV）,构建携带绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组载体,探索能高效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFFs）的病毒系统和感染方法.结果发现,2种逆转录病毒系统包装出的重组病毒滴度都能达到10⁶,将pMX病毒系统生产的重组病毒经超速离心浓缩后,滴度可达到10⁷;2种重组病毒都能感染BFFs,但pMX系统比pMSCV系统更能有效地感染BFFs;通过对病毒的感染方式进行比较,发现使用新鲜病毒连续感染BFFs 2次（每次间隔12 h）,或者经过超速离心浓缩后的病毒感染BFFs 1次,可以显著提高感染效率.     

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX—IRES—GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX—Sox2-IRES—GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据．     

禽内源性逆转录病毒

本文对有关禽内源性逆转录病毒(Avain Endogenous Restroviruses,AERs)的多样性、结构、表达和可能的进化方式等最新研究结果进行了总结和分析,同时还讨论了内源性逆转录病毒在个体发育和病理学方面所起的作用。     

用逆转录病毒法制作鸡输卵管生物反应器的研究

本文综述了鸡的生物反应器和逆转录病毒法的研究，目前逆转录病毒法是制作鸡生物反应器的最合适的方法。