家蚕金属羧肽酶基因家族的鉴定与表达分析

金属羧肽酶是昆虫消化管中参与食物消化吸收的重要酶类,并可能在昆虫变态、发育、抗病免疫等多种生命过程中发挥重要作用。利用家蚕全基因组数据库,基于同源搜索和隐马尔可夫模型搜索相结合的方法,对家蚕金属羧肽酶基因家族进行鉴定。全基因组预测家蚕的金属羧肽酶基因家族包括22个成员,推导的氨基酸序列均具有锌离子结合位点和金属羧肽酶M14的保守特征。根据其保守氨基酸序列不同,家蚕的金属羧肽酶分属于M14A、M14B和M14D 3个亚家族。通过RTPCR方法检测显示22个家蚕金属羧肽酶基因中有18个基因在家蚕不同组织和发育时期中表达,其中7个基因在家蚕5龄第3天幼虫中肠组织特异高量表达,提示金属羧肽酶在家蚕对营养物质的消化吸收中有重要作用;家蚕5龄幼虫添食感染Bm NPV后24 h内,中肠中有5个金属羧肽酶基因上调表达,表现出对病原微生物侵染的应答反应。研究结果有助于解析家蚕金属羧肽酶在蚕体对营养物质的消化和对病原物入侵应答中的功能作用。     

草鱼羧肽酶A1基因(CPA1)部分片段的单核苷酸多态性(SNP)多态性及其与生长性状的关联分析

羧肽酶A (EC 3.4.16)是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸残基的消化酶.在草鱼生长相关的功能基因上研究单核苷酸多态性(SNP)与生长的相关性可为草鱼的分子辅助育种提供依据.本研究根据草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST-SNP库的羧肽酶A1基因(CPA1)重叠群的2个Contig扩增该基因的序列片段,采用直接测序法,经过序列比对,共筛到2个颠换SNP位点:C+412A和A36C,分别位于CPA 1基因外显子5的34bp和内含子3的36 bp处,前者为错义突变.然后用一个群体的296尾草鱼对这2个位点用SnaPshot的方法进行检测和分型,统计基因型频率:A36C位点的AA基因型占26.7％,AC基因型占52.0％,CC基因型占21.3％.C+412A位点的AA基因型占15.5％,AC基因型占40.5％,CC基因型占43.9％.利用一般线性模型分析2个SNP位点与草鱼体质量、体长等重要生长性状的关系.关联分析结果显示,C+36A位点不同基因型在体质量、眼间距均值上存在显著差异(P＜0.05).并且AA基因型和CC基因型在体质量、体长、体宽和眼间距上存在显著差异(P＜0.05).AA基因型各项指标均值显著高于CC基因型.C+412A位点在体质量等生长性状上差异不显著(P＞0.05),该位点和生长不相关,但是CC基因型和AC基因型在体重和肛前距上差异显著(P＜0.05),该位点CC基因型的6个生长性状均值都高于AA基因型.由两个位点组成的5种双倍型在体质量上存在显著差异(P＜0.05).双倍型D3和D5在体质量上存在差异显著(P＜0.05).双倍型D3和D8在体质量、体宽、体长、体长/头长等生长性状上都存在显著差异(P＜0.05).D3的各项指标均值最高,D8的各项指标均值最低.本研究结果显示,可以考虑将草鱼CPA1基因作为候选基因,用于草鱼的分子辅助育种.     

茶树丝氨酸羧肽酶基因的克隆及表达分析

近年来,人们发现丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL)参与植物次生代谢产物的酰基转移过程,即具有转酰基功能。本研究采用RT-PCR技术,获得了3个茶树丝氨酸羧肽酶基因的全长序列;生物信息学分析表明,3个CsSCPL蛋白均包含了1个底物结合位点、3个催化作用保守区和多个N-糖基化位点,及其Ser-Asp-His三联体催化中心等SCPL家族的典型特征;进化树分析表明,3个CsSCPL可能具有酰基转移酶的功能。实时荧光定量PCR结果表明3个基因在芽叶茎根中都有表达,其中,CsSCPL1和CsSCPL3在叶中的相对表达量明显高于茎和根,而CsSCPL2则在根中高表达。本研究成功地将CsSCPL重组到表达载体pET32a(+)上进行原核表达,并对诱导时间及诱导温度进行了优化;经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,目标蛋白条带分子量为70 kD,与预测大小相符。     

羧肽酶A/B水解虾副产物制备ACE抑制肽

为了获得血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,使用α-胰凝乳蛋白酶对虾副产物进行预酶解,再选择羧肽酶A/B进行酶解,通过透析和凝胶层析纯化后,测定分离肽的ACE抑制活性。通过检测水解度,确定α-胰凝乳蛋白酶的最优水解时间为4h,羧肽酶A/B最优水解时间为6h。两步酶解产物的ACE半抑制浓度(IC50)值为6.39mg/mL。通过透析,得到500Da和500~1 000Da 2个抑制活性更高的组分,IC50分别为1.69和2.87mg/mL。进一步通过Sephadex G-15凝胶层析分离,得到4个IC50值小于0.2mg/mL的组分,其中组分F8最低,为0.134mg/mL,显示了较高的ACE抑制活性。该结果验证了羧肽酶A/B酶解可制备出高活性ACE抑制肽。     

HLXN基因产物人羧肽酶A抑制剂的表达与纯化

目的：表达并纯化HLXN编码蛋白latexin。方法：用IPTG诱导含重组质粒HLXN—pQE30的E．coli M15表达latexin蛋白；HiTrap^TM Chelating层析柱纯化基因工程his6-latexin蛋白；SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量；考马斯亮蓝法测定超滤液中蛋白浓度。结果：由HLXN表达产物制备和提纯得到了纯化his6-latexin蛋白；该蛋白的分子量为32kD;蛋白含量为2．67g／L。结论：HLXN编码蛋白latexin的成功表达与纯化为进一步研究探讨HLXN基因的生物学功能、与人类临床疾病的关系以及在临床的应用奠定了基础。     

南极磷虾羧肽酶的适冷特性及蛋白质结构预测

研究南极磷虾羧肽酶的适冷特性,探讨其在催化反应过程中应对低温环境的机理,对酶类分子改造等基础学研究及实际生产应用具有一定意义。本研究首先比较了南极磷虾羧肽酶及牛(胰)羧肽酶的动力学,对其适冷性进行了分析,接着采用生物信息学方法,对其理化性质和氨基酸序列进行比对,并进行二级、三级结构预测,对南极磷虾羧肽酶的结构与适冷性关系进行探讨。结果显示,在4和30℃下,南极磷虾羧肽酶催化效率及对底物的亲和性均高于常温下的牛(胰)羧肽酶,更能适应低温环境。通过结构分析预测,南极磷虾羧肽酶氨基酸序列与河鳌虾等物种同源性较高,活性位点、Zn结合位点等存在保守性;不同的是与其他恒温动物相比南极磷虾羧肽酶含有更高比例的Asp和较低比例的Pro、Arg、Phe,可能致使其蛋白质分子内相互作用减弱,分子柔性增强;二级元件中松散的无规则卷曲占比相对较高,使得南极磷虾羧肽酶三级结构呈现出活性中心更暴露、整体结构更松散的状态。南极磷虾羧肽酶具有一定的适冷性,酶分子各级蛋白结构基于降低分子间作用力、提高分子柔性和减少活性位点空间位阻等,为其应对低温环境并保持较高效的催化能力起到了一定的作用。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ蛋白酶活性的研究

植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lb.pzantarum ST-Ⅲ)是一株具有降低血清胆固醇能力的益生菌,其在脱脂乳中生长缓慢,产酸能力弱.实验选取一株凝乳性较好的植物乳杆菌CZ 2112作为参照,对植物乳杆菌ST-Ⅲ蛋白酶活性进行研究.植物乳杆菌ST-Ⅲ蛋白酶活性及蛋白水解能力比植物乳杆菌CZ 2112低,而氨肽酶和羧肽酶活性与之差异较少,推测得出植物乳杆菌ST-Ⅲ在脱脂乳中不能很好生长和凝乳的原因是该菌株蛋白酶活性较低,生长初期不能很好利用外源蛋白质营养.在添加鱼蛋白胨等促进生长后,植物乳杆菌ST-Ⅲ可以将蛋白质、多肽水解成一系列的寡肽或氨基酸,满足菌体生长的氮素营养.     

控释尿素施用方式对玉米穗位叶氮代谢的影响

试验通过设置4种尿素施用方式,即控释尿素侧施5 cm(C5)和10 cm(C10),控释尿素底施15 cm(CB),普通尿素侧施5 cm(U5),研究其对玉米穗位叶可溶性蛋白和游离氨基酸含量,以及硝酸还原酶、内肽酶和羧肽酶活性的影响。结果表明,与常规尿素相比较,控释尿素深施能够显著提高玉米灌浆中后期穗位叶可溶性蛋白和游离氨基酸含量,以及硝酸还原酶和蛋白水解酶活性;4个处理中以底施效果最优,其次是侧施10 cm。     

草鱼羧肽酶A4基因部分序列多态性及生长性状关联分析

[目的]筛选出更多与草鱼生长相关的SNP位点标记,为草鱼分子育种研究提供理论依据.[方法]根据草鱼EST数据库中属于消化酶的羧肽酶A4基因的cDNA序列设计引物,采用PCR产物直接测序法,对含预计SNP位点的cDNA序列进行扩增、测序,并寻找新的SNP位点.[结果]cDNA上预计的SNP位点不存在,但在内含子3上检测到两个SNP位点,分别位于内含子的第40、241个碱基处,命名为A40G位点和G241T位点.经创造酶切位点的限制性片段长度多态检测(CRS-RFLP),发现A40G位点AA型占50.3%、AG型占23.8%、GG型占25.9%,G241T位点的GG型占48.6%、GT型占47.9%、TT型占3.5%.利用一般线性模型(GLM)将两个SNP位点与草鱼6个生长性状进行关联分析,结果表明,A40G位点的GG型个体在体重、体长、体高均高于AA型和AG型,但差异不显著(P>0.05);G241T位点TT型个体最重,GG型最轻,但差异不显著( P>0.05);A40G和G241T两个位点组成的7种双倍型个体的体重、体长、体高、尾柄高等重要生长性状差异也不显著(P>0.05).[结论]在草鱼羧肽酶A4基因的内含子3上发现两个SNP位点(A40G位点和G241T位点),每个SNP位点都可分为3种基因型,但两个SNP位点的不同基因型以及由其组成的双倍型与草鱼的重要生长指标均不存在显著相关.     

水稻与拟南芥全基因组丝氨酸羧肽酶类蛋白家族比较分析(英文)

    基于水稻与拟南芥全基因组序列,在基因组与蛋白质组水平上对这2种模式植物的丝氨酸羧肽酶 (SCPs)基因家族进行比较分析.利用隐马可夫模型(hidden Markov models,HMM),发现水稻与拟南芥中分别存在71个与54个丝氨酸羧肽酶类(serine carboxypeptidases like,SCPL)蛋白编码基因,它们广泛分布于基因组中各条染色体上,并且存在多个基因簇聚区.基因结构分析显示,拟南芥的SCPL基因存在广泛的交替剪接方式,而这种现象在水稻SCPL基因中却不常见.蛋白结构分析表明,所有SCPL家族成员均具有α/β水解酶折叠亚族与S10家族典型的保守结构域与二级结构特征.系统进化分析表明,这125个SCPL蛋白可以分成3大类,与水稻不同,大多数拟南芥SCPL (88.9%)可归属于双链羧肽酶Ⅰ或Ⅱ.