鸡毒霉形体TM-1基因原核表达载体的构建及表达

对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒，进行EcoR Ⅰ和Sα／Ⅰ双酶切，获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。提取质粒，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确，从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，证明其分子质量约为29ku；Western-blotting分析表明，该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别，具有生物学活性。     

山羊痘病毒SS株5个ANK基因缺失的重组病毒构建

为研究锚定蛋白基因(Ankyrin,ANK)对山羊痘病毒的影响,试验采用融合PCR和Overlap PCR技术扩增山羊痘病毒SS株5个ANK基因(ANK010、ANK138、ANK 140、ANK141.2和ANK145)两端侧翼序列和绿色荧光蛋白(GFP)基因,并将其产物连接Trans1-T 1载体构建ANK缺失的转...     

一株喹诺酮耐药大肠杆菌耐药基因检测

黑龙江省齐齐哈尔市周边发生了仔猪腹泻情况,通过检测发现致病菌为致病性大肠杆菌。通过药敏试验发现其对恩诺沙星、左氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药。通过PCR探究其携带的耐药基因,发现其含有喹诺酮耐药基因aac(6’)-Ib-cr。表明该株大肠杆菌为质粒介导的喹诺酮耐药菌株,通过aac(6’)-Ib-cr基因编码的变种氨基糖苷甲基转移酶修饰喹诺酮类药物,从而导致药物抗菌活性下降,菌株产生了药物耐药性。     

铜绿假单胞菌oprH基因DNA疫苗的构建与检测

研究旨在构建铜绿假单胞菌oprH基因的DNA疫苗。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌的oprH基因序列,设计合成了一对特异性引物,利用PCR技术由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得该目的基因,进行胶回收纯化并与T载体进行连接,经双酶切和PCR鉴定后将重组质粒进行酶切回收目的基因片段,并将其亚克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中,以双酶切和PCR方法进行鉴定。结果显示：PCR成功扩增出约600 bp的oprH基因,连接T载体后的重组质粒经双酶切和PCR鉴定,均可获得大小正确的目的基因片段。真核重组载体鉴定结果显示,oprH基因成功克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中。研究表明,试验成功构建了oprH基因的DNA疫苗,为进一步研究其免疫效果及铜绿假单胞菌新型疫苗的研制提供参考。     

水泥环向非均匀胶结时套管井井孔声场数值仿真试验

随着我国油气勘探开发逐渐向深水、深地以及深海等复杂测井环境拓展,高温高压等特殊的井下条件给油田固井造成了很大的困难,水泥浆和地层压力之间较窄的压力窗口,使得固井水泥浆凝固过程中地层流体易侵入水泥浆形成窜槽,造成水泥环向胶结不均匀,研究此情况下的测井响应对可靠评价固井质量至关重要。通过三维交错网格高阶有限差分方法数值模拟和实验室测量研究了CBL/VDL(cement bonding log(声波幅度测井),variable density log(声波变密度测井))和扇区水泥胶结测井SBT(segment bond tool)在水泥环向胶结非均匀时的响应特征。数值计算和实验室测量结果都表明,对高密度水泥浆,随着环向水泥缺失程度越来越大,CBL/VDL套管波相对幅度逐渐增大,但在环向水泥缺失角度小于90°时,套管波相对幅度的增强不明显;扇区水泥胶结测井SBT对测量源距范围内的水泥缺失比较敏感,套管波幅度基本随着水泥缺失面积的增加呈线性增加,即SBT对环向较小区域的水泥缺失更敏感,分辨率更高。该研究通过定量描述扇区水泥缺失率与套管波相对幅度的关系,可提高现场对水泥胶结评价结果的认识。     

导入外源GHRH基因质粒对犊牛健康的影响

国内外研究表明,生长激素释放激素（Growth Hormone Releasing Hormone,GHRH）基因质粒可以提高家畜的生长速度,增加饲料报酬,减少胴体中的脂肪含量,而转GH基因动物经常表现出健康异常,牛生长激素在国内外的应用也大都因为其可能引起动物疾病而饱受争议。本试验将构建的GHRH基因质粒首次应用于牛,在实际的生产中,此质粒同样可能对犊牛的健康造成不同程度的影响,     

牛朊蛋白单氨基酸变异体的原核表达

应用pGEX原核表达载体构建了牛朊蛋白的1个正常重组蛋白和3个单氨基酸变异体的原核表达质粒，即pGEX-BoPrP(93～241)、pGEX-BoPrP(93～241)(S154N)、pGEX-BoPrP(93～241)(A129V)和pGEX-BoPrP(93～241)(Q234R)。经转化E．coli BL21(DE3)．均表达了预期大小约为42．4ku的融合蛋白。在优化的诱导表达条件下，各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。经免疫印迹检查，所有融合蛋白均可与抗牛单克隆抗体4C11反应。表明，单氨基酸突变并不影响单抗4C11的识别表位。     

含PRRS病毒ORF5的伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体的构建

提取伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）ＢａｒｔｈａＫ６１株基因组ＤＮＡ,用限制性内切酶ＫｐｎＩ充分消化,回收５．９ｋｂ片段（Ｊ片段）,将其克隆于质粒ｐＵＣ１１９ ＫｐｎＩ位点上,获得ｐＢＫＪ。用两对针对ＰＲＶ ＴＫ基因的特异性引物对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定,证明其中含有ＰＲＶ ＴＫ基因。然后用ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱。进一步研究证实ＴＫ基因位于其中的     

S2基因失活突变马传染性贫血病毒感染性克隆的构建及感染性研究

为研制马传染性贫血病毒(EIAV)标记疫苗株,本研究在EIAV驴胎皮肤(FDD)细胞弱毒疫苗株感染性克隆pEIAVFDDV3-8的S2基因内部引入两个终止密码子,致使S2基因终止表达,构建了一株S2基因突变的感染性克隆pEIAVFDDV3-8△S2。用该重组质粒转染FDD细胞,盲传至第4代时,转染细胞病变明显,电镜下可见细胞内的典型病毒颗粒。反转录酶活性检测和Real-time PCR对病毒拷贝数的检测均证明,获得了EIAVS2基因终止表达的感染性克隆毒株,命名为EIAVFDDV3-8△S2。