内含NDV核酸的耐核糖核酸酶病毒样颗粒作为荧光定量RT-PCR内标的制备与鉴定

为制备检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR病毒样颗粒内标,扩增MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列,将其定向插入pET32a载体的相应位置,双酶切和PCR鉴定,构建pET32a-MS2重组质粒;根据新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测的目标片段,采用化学合成和klenow酶连接技术制备内标片段,将内标片段插入pET32a-MS2重组质粒,构建pET32a-MS2-IC重组质粒,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经RNase和DNase消化后,采用荧光RT-PCR检测耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标的含量。结果表明,制备了高表达量耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标,可用于新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立。     

大骨鸡中MSTN基因表达规律性的研究

本实验以大骨鸡为试材,采用RT-PCR法检测了MSTN基因在大骨鸡不同器官、不同时间的表达情况,结果表明MSTN基因在骨骼肌中表达水平较高,在心肌、肾脏、脑、肠、舌中也有微量表达,但在肺、肝脏中未检测出MSTNmRNA,而且在14日龄时表达水平明显低于35日龄和56日龄,而且在孵化后一周时胸肌中MSTN基因的表达水平达到最低。     

番木瓜环斑病毒株系的分子生物学方法鉴定

 以PRSV株系特异性引物对PRSV的PRSV126(PRSV日本分离物)、Ys、Vb和Sm等株系进行RT-PCR方法鉴定,引物PR21/PR22能把Ys从Vb和Sm中鉴定出来,PR300/PR301则能把Vb从Ys、Sm和PRSV126中鉴定出来;用限制性内切酶Hae Ⅱ、Sau3A I和Hinf I对PRSV的PRSV126、Ys、Vb和Sm等株系进行单酶切RT-PCR-RFLP分析,Hinf I能把PRSV126与Ys、Vb和Sm鉴别开来,Sau3A I能把Ys与Vb和Sm鉴别开来,Hae Ⅱ则能把Ys与PRSV126、Vb和Sm鉴别开来;以P1/P2为引物,对Vb、Ys和Sm株系进行RT-PCR-RFLP-SSCP分析,结果能一次把三者较好地区别开来。     

利用RT-PCR检测库尔勒香梨苹果茎痘病毒的研究

 以库尔勒香梨新鲜、冷藏、冷冻叶片和皮层为材料,对提取双链RNA (dsRNA)的2种方法和提取总RNA的3种方法进行了分析比较,并对总RNA的提取方法进行了改进,获得了纯度较高、完整性较好的dsRNA和总RNA,在此基础上进行了反转录(RT)和PCR扩增。在国内首次完成了对苹果茎痘病毒(ASPV)的RT-PCR检测,建立了ASPV有效RT-PCR反应体系。用此体系扩增到ASPV一个长约316 bp的片段。实验表明以dsRNA和总RNA为模板均能成功进行RT-PCR检测,且dsRNA优于总RNA。     

不同引物对植原体的检测灵敏度比较研究

用常规PCR和巢式PCR对目前常用的各种植原体引物(fPl/rP7、fU5/rP7、fU5／rU3、fAY/rEY和fFD9/rFD9)的检测灵敏度进行了比较研究。研究发现，它们的检测灵敏度并不相同。最灵敏的引物(fAY/rEY)要比最不灵敏的引物(fFD9/rFD9)的灵敏度至少高出数千倍。因此，按照不同的检测目的选择所用的检测引物是明智的，特别是当待测样品中的植原体浓度极低时，比如葡萄组织样品中植原体的检测。据此提出了用于不同检测目的时的最佳引物。     

检测猪流行性腹泻病毒的R-PCR方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 641bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测的猪流行性腹泻病毒的RT PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的RT PCR检测结果均呈阴性。对PEDV JS株的RT PCR产物的序列分析表明 ,与CV777株的同源性为 97 3 %。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪瘟病毒(CSV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)现场快速鉴别检测方法,参照GenBank中CSV和PRRSV特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测CSV和PRRSV的一步法荧光RT-PCR方法,并验证了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,该方法检测CSV和PRRSV的灵敏度分别可达0.25和1.99 TCID_(50)/100μL,对猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法,可对CSV和PRRSV进行快速诊断,适合现场检测。     

猪瘟病毒NASBA-RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究基于核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)和反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种针对猪瘟病毒的,快速、灵敏、特异的两步法检测技术。该方法的检测灵敏度与反转录巢式PCR(RT-NestPCR)相当,最低能检测出46 pg/μL的病毒RNA。该方法的建立为猪瘟病毒的快速诊断提供了新思路。     

猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用

猪δ冠状病毒(PDCo V)是2014年在美国最新检测出的一种猪源冠状病毒。为评估PDCo V在我国的感染和流行情况,根据Gen Bank中登陆的PDCo V M基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,建立了一种基于M基因的猪δ冠状病毒RT-PCR检测方法。研究结果表明,该方法特异性较好,仅对PDCo V有特异性的扩增,对其它主要猪病病毒核酸扩增均呈阴性;敏感性较高,最低检测限可达6.33×104拷贝/μL。运用该方法对我国华东地区猪场2014~2015年间的492份临床样品进行检测结果显示,PDCo V总阳性率为2.85%(14/492),其中腹泻样品中阳性率为18.60%(8/43),表明本研究建立的RT-PCR方法可以对临床样品进行有效检测。     

PRRSV、CSFV与SIV三重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)与猪流感病毒(SIV)三重RT-PCR方法,根据Gen Bank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的RT-PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364 bp(PRRSV)、530 bp(CSFV)和981 bp(SIV)。通过试验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PRRSV、CSFV和SIV的核酸检测最低浓度分别为3.2×10-2、8.3×10-2和3.7×10-2ng。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有力手段。