分泌抗鸡Ig单抗杂交瘤细胞系的建立与单抗生物学特性的鉴定

从传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞系１Ｄ１０、１Ｇ１中得到了３株能稳定分泌抗鸡免疫球蛋白（Ｉｇ）ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系１Ｂ７、１Ｄ７、３Ｇ６。其抗体类和亚类均属ＩｇＧ２ｂ，腹水的ＥＬＩＳＡ效价≥１∶２５６００，琼扩效价为１∶８～１∶１６。３株ＭｃＡｂ能与鸡血清中的Ｉｇ出现沉淀反应，琼扩在２４ｈ以内出现清晰的沉淀线，而不能和鸭、鸽、鹌鹑等禽类及异种动物血清出现沉淀线。纯化的鸡ＩｇＧ、ＩｇＭ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后，分别用纯化并经辣根过氧化物酶（ＨＰＲ）标记的１Ｂ７、１Ｄ７、３Ｇ６单抗酶结合物进行免疫印迹试验证明，３株单抗识别的均为ＩｇＧ、ＩｇＭ分子的轻链     

破壁蜂花粉对蛋鸡免疫功能及肠道菌群的影响

试验将槐花蜂花粉进行振动磨超微粉碎破壁,分别按1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg三个不同剂量混到蛋鸡饲料中,从7日龄开始饲喂至50日龄,每个剂量分两个试验,试验一用新城疫Ⅳ系疫苗免疫雏鸡,利用β-微量法监测血清中的血凝抑制抗体效价的动态变化;试验二用大肠杆菌油乳苗免疫雏鸡,利用间接血凝法监测血清中大肠杆菌抗体效价的动态变化。分别定期称重捕杀取脾、胸腺、法氏囊,计算免疫器官指数,取肠道内容物计数大肠杆菌和乳酸菌,测定肠道内pH值。结果表明,不同剂量的破壁蜂花粉均能不同程度地提高病毒抗原性抗体效价和菌体抗原性抗体效价,对雏鸡免疫器官的发育以及肠道内环境、菌群的平衡也有一定影响。     

不同营养水平对种公鸡新城疫抗体水平的影响

研究选择21周龄新扬州鸡种公鸡135只,随机分成9组。采用两因子析因设计,分别设粗蛋白质水平为17%、14%和11%,钙水平为3.3%、2.3%和1.3%,构成9种日粮处理。比较在繁殖期全程饲喂不同粗蛋白质和钙水平日粮对种公鸡新城疫水平的影响,结果表明:日粮粗蛋白质水平对免疫后15、30天公鸡体内的抗体水平有显著影响(P<0.05),对免疫90天的水平有极显著影响(P<0.01);日粮钙对免疫后30天的抗体水平有极显著的影响(P<0.01);二者的交互作用对它影响不显著(P>0.05);低蛋白低钙组抗体水平显著高于高蛋白高钙组(P<0.05)。     

Identification of a conservative site in the African swine fever virus p54 protein and its preliminary application in a serological assay

BackgroundASF was first reported in Kenya in 1910 in 1921. In China, ASF spread to 31 provinces including Henan and Jiangsu within six months after it was first reported on August 3, 2018. The epidemic almost affected the whole China, causing direct economic losses of tens of billions of yuan. Cause great loss to our pig industry. As ELISA is cheap and easy to operate, OIE regards it as the preferred serological method for ASF detection. P54 protein has good antigenicity and is an ideal antigen for detection.ObjectiveTo identify a conservative site in the African swine fever virus (ASFV) p54 protein and perform a Cloth-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting the ASFV antibody in order to reduce risks posed by using the live virus in diagnostic assays.MethodWe used bioinformatics methods to predict the antigen epitope of the ASFV p54 protein in combination with the antigenic index and artificially synthesized the predicted antigen epitope peptides. Using ASFV-positive serum and specific monoclonal antibodies (mAbs), we performed indirect ELISA and blocking ELISA to verify the immunological properties of the predicted epitope polypeptide.ResultsThe results of our prediction revealed that the possible antigen epitope regions were A23–29, A36–45, A72–94, A114–120, A124–130, and A137–150. The indirect ELISA showed that the peptides A23–29, A36–45, A72–94, A114–120, and A137–150 have good antigenicity. Moreover, the A36–45 polypeptide can react specifically with the mAb secreted by hybridoma cells, and its binding site contains a minimum number of essential amino acids in the sequence 37DIQFINPY44.ConclusionsOur study confirmed a conservative antigenic site in the ASFV p54 protein and its amino acid sequence. A competitive ELISA method for detecting ASFV antibodies was established based on recombinant p54 and matching mAb. Moreover, testing the protein sequence alignment verified that the method can theoretically detect antibodies produced by pigs affected by nearly all ASFVs worldwide.     

引起浙贝母黑斑病的交链格孢单抗及检测试纸条的制备

浙贝母黑斑病是危害浙贝母茎叶的重要真菌性病害之一, 该病侵染叶片产生叶斑?叶枯, 严重时全株枯死?本研究制备了针对浙贝母黑斑病致病菌交链格孢Alternaria alternata的单克隆抗体(单抗), 并开发了胶体碳免疫层析试纸条用于黑斑病早期精准检测?以交链格孢提取液免疫Bal b/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备单抗, 间接ELISA法和Western blot分析单抗的效价?灵敏度?特异性?抗体类型及结合蛋白?以双抗夹心法制备胶体碳免疫层析试纸条?得到3种针对交链格孢的单抗及其杂交瘤细胞株AaA1?AaC2和AaC5?3种单抗对交链格孢均具有高度特异性, 灵敏度为12.21~24.41 ng/mL, 效价≥6.40×105, 抗体类型分别为IgG2a?IgG3和IgG3, 结合蛋白的分子量分别为37?62 kDa和66 kDa?以AaA1为碳标单抗, AaC2为划膜单抗的胶体碳试纸条检测交链格孢的方法快速简便?准确灵敏?经济环保?从田间采样到出结果用时少于15 min, 样品简单研磨后取汁液加入加样孔即完成全部操作, 对交链格孢抗原的检测灵敏度为6.25 μg/mL, 试纸条采用环保材料制备, 单个试纸条的成本约1.7元?     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

利用禽流感H9亚型病毒(AIV-H9)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经免疫荧光试验(IFA)检测,以研制抗禽流感病毒(AIV)单克隆抗体。结果获得了5株特异性抗AIV核蛋白(NP)的单克隆抗体细胞株,分别命名为AIV-NP-2C3、AIV-NP-6A5、AIV-NP-3H9、AIV-NP-7B4、AIV-NP-2H4。这5株单克隆抗体能与所有试验的AIV-H9病毒反应,Western blotting方法鉴定结果表明,单克隆抗体仅识别60 ku的蛋白抗原,而不与新城疫病毒、禽网状内皮组织增殖症病毒、传染性法氏囊病毒等反应。初步应用结果显示,以这些单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验或ELISA方法可迅速检测出禽流感病毒,这些单克隆抗体在禽流感的预防监测中将发挥重要的作用。     

间接ELISA法对禽霍乱抗体的动态监测

将40只50日龄健康禽霍乱非免疫鸡随机分为四组,每组10只。用禽霍乱蜂胶佐剂灭活疫苗对各组鸡进行不同水平的免疫,同时设非免疫对照组。各组鸡间隔5-7天采血,以间接ELISA法测定血清P／N值,并确定临界值。将P／N值在2.1-4.7的13只试验鸡以一个最小致死量（相当于10个菌／ml）进行攻毒试验,同时设攻毒对照,在1周内3只对照鸡均表现感染发病并死亡,而试验鸡均健活,从而初步证明所确定的临界值是合理的。     

金黄色葡萄球菌FnbpA、ClfA、Ebps抗原表位的串联表达及多克隆抗体的制备

为获得金黄色葡萄球菌特异性抗原蛋白并以此制备多克隆抗体,应用DNAStar软件筛选金黄色葡萄球菌FnbpA、ClfA、Ebps的抗原表位,以柔性氨基酸序列连接后进行全基因合成,将目的基因克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化至大肠杆菌感受态细胞,诱导表达,采用Sepharose 4B柱亲和层析纯化表达蛋白,制备抗原后对家兔进行皮下多点注射,于第42天采集外周血,获得血清。结果表明,本试验成功构建了金黄色葡萄球菌抗原基因表达载体,并获得了高免血清,经ELISA的方法检测血清效价可达到1∶10000以上,成功制备多克隆抗体,为以后采用免疫学方法快速检测金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

狂犬病病毒BD-06株基质蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为进一步研究M蛋白功能提供材料。本试验以狂犬病病毒BD06毒株为模板克隆M基因序列,将其克隆至原核表达载体pET28a;经酶切和测序鉴定,M蛋白基因序列已正确插入表达载体pET28a;以表达载体pET28a-M转化E.coli Rosetta株,并以0.5 mmol/L IPTG诱导,结果表达出27 ku左右的M蛋白;将诱导表达的蛋白质回收纯化,以纯化的M蛋白多次免疫兔子制备多克隆抗体;Western blotting分析和间接免疫荧光分析结果表明,制得的抗体与病毒能够反应,运用制得的多克隆抗体定位了基质蛋白在感染狂犬病病毒的BHK-21细胞中的位置。结果表明成功制得了抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为研究狂犬病病毒M蛋白功能奠定了基础。     

O型口蹄疫疫苗免疫牛抗体消长动态的LPB-ELISA检测

分别按一次免疫、首免后第15d加强免疫和首免后第60d加强免疫程序，对3组试验牛（每组牛20头）用O型口蹄疫疫苗进行了免疫。免疫后不同时间点用液相阻断ELISA（LPB-ELISA）测定了免疫牛O型口蹄疫抗体效价。结果，首免后第15d加强免疫牛和第60d加强免疫牛抗体水平较高，50％保护牛所占比例分别为56．3％和63．1％，完全受保护的牛所占比例分别为34．3％和29．5％。第60d加强免疫牛的保护率要高于第15d加强免疫牛和一次免疫牛的保护率。结果表明，首免后第60d加强免疫是最理想的免疫程序。