1株鸭源非O1/O139群霍乱弧菌的分离鉴定与致病性分析

为探明引起贵州省某鸭场雏鸭发病的病原及其致病性和耐药情况，本研究对该鸭场送的疑似细菌感染病鸭进行剖检，取鼻黏膜、心脏和肝脏等组织器官接种于培养基中进行细菌分离鉴定，通过对分离菌进行药敏试验、动物回归试验和毒力基因检测研究其耐药情况和致病性。结果显示，分离菌在血琼脂培养基上生长16 h后呈现为边缘整齐、有光泽的乳白色菌落，伴有β-溶血现象，经革兰氏染色后在生物显微镜下呈两端钝圆、弧状、排列无规则的革兰氏阴性短小杆菌，与霍乱弧菌相符；16S rDNA基因序列同源性及系统进化树显示，该分离菌与霍乱弧菌同源性高达99.6%~99.7%聚为一支；药敏试验结果显示，分离菌对大部分药物都表现为耐药，其中对氨苄西林、克林霉素、复方新诺明、苯唑西林和克林霉素等抗菌药耐药性较强，对头孢哌酮和头孢曲松敏感；动物回归试验显示，分离菌可导致试验组雏鸭5 d内全部发病死亡，表明该分离菌对雏鸭具有较强的致病性；毒力基因PCR检测结果显示，检测的霍乱弧菌相关毒力基因hlyA、ompW和chxA为阳性，而检测的O1群rfb、O139群rfb、tcpA及ctxA基因为阴性，表明本次分离的霍乱弧菌携带有致病基因，但不属于O1和O139血清群。结果表明，该鸭场雏鸭发病的疫情病原为非O1/O139血清群霍乱弧菌，该菌致病性强且对多种抗菌药物耐药。本试验结果为贵州省鸭霍乱弧菌病的防控提供了参考依据。     

鱼肠道弧菌免疫检测方法的研究

采用灭活的鱼肠道弧菌作为抗原,制备兔抗血清,建立了鱼肠道弧菌的间接荧光抗体检测技术(indirect im-munofluorescence assay test,IFAT)、Western-blotting免疫印迹检测技术。IFAT结果显示阳性信号覆盖整个菌体,明亮,清晰,荧光信号呈长弧形且两端钝圆,与鱼肠道弧菌形状一致。Western-blotting结果显示共10条蛋白带发生免疫反应,其中6条蛋白带结果较清晰,显示出较强的特异性免疫反应,阴性对照组无条带。IFAT和Western-blotting结果说明所建立检测方法能够准确、快速的检测出鱼肠道弧菌。     

南美白对虾养殖系统中弧菌为主的致病菌群的分子比较

弧菌是最常见、最重要的细菌性病原菌,采用16 S rDNA克隆文库法对南美白对虾(Litopenaeus vannarnei)养殖系统中水体和底泥的弧菌为主的致病群落的组成进行分析研究。从水体和底泥16 S rDNA克隆文库中各随机挑选55个克隆子进行测序(约114 bp),对测序结果进行了BLAST比对。结果表明:水体样品有16个OTU,主要Vibrio(弧菌,33.3%)、Chloroflexi(绿屈挠菌,18.5%)和Pantoea(泛菌属菌,7.41%);底泥样品有14个OTU,主要是Vibrio(弧菌,50.0%)和Chloroflexi(绿屈挠菌,13.6%);2个文库比较来看,proteobacterium(变形细菌)仅在水体样品中,Aeromonas(气单胞菌)仅在底泥样品中。用MEGA 4从测序的克隆子中选出30个OTU进行系统发育分析。     

拟态弧菌外膜蛋白OmpU 基因的原核表达及其免疫保护性研究

自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEx-4T-1-OmpU.将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21进行IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9 kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性.用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×103CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15).表明OmpU是拟态.弧菌的保护性抗原之一,具有研发成为外膜蛋白基因工程亚单位苗的潜在价值.     

红鳍东方皮肤溃烂病病原菌的分离与鉴定

从体表溃烂的养殖红鳍东方鲀(Fugu obscurus)病灶处分离到1株优势生长菌,编号为H-06091.分别通过创伤浸泡和注射方式感染健康红鳍东方鲀,发现这两种途径均可引发皮肤溃烂,两种途径的感染率均为100%,2×108 cell/mL.菌浓度注射组死亡率为100%,4×107 cell/mL菌浓度注射组死亡率为50%,创伤浸泡感染未见死亡.药敏实验表明,复方新诺明、呋喃妥因、链霉素、环丙沙星、利福平、红霉素、氟哌酸、氟嗪酸、庆大霉素、阿米卡星、四环素、青霉素G等抗菌素对H-06091有较强的抑制作用.按照<常见细菌系统鉴定手册>进行菌种鉴定并测定其16S rRNA基因序列,结果表明,该菌呈革兰氏染色阴性,氧化酶阳性,接触酶阳性,V-P试验阴性,硝酸盐还原反应阳性等特征,符合哈氏弧菌(Vibrio harveyi)特征,其16s rRNA基因序列与GenBank中哈氏弧菌同源性为99%,因此将H-06091鉴定为哈氏弧菌.     

噬菌蛭弧菌对乌鳢养殖水质的影响

为了探讨噬菌蛭弧菌制剂净化水质和病害防治的效果,试验以0.75 mL/m2的用量向乌鳢养殖池泼洒浓度为1.0×108pfu/mL的噬菌蛭弧菌制剂,观察7 d内养殖池的pH、DO、NH3-N、NO2--N含量及弧菌总数等主要水质指标以及乌鳢死亡数目的变化。向乌鳢养殖池加入噬菌蛭弧菌后,试验组与对照组相比,NH3-N、NO2--N含量及弧菌总数明显减少(p<0.05),DO明显增大(p<0.05),但pH变化不明显(p>0.05);乌鳢死亡率也明显减少(p<0.05)。试验结果表明,以0.75 mL/m2的用量向乌鳢养殖池泼洒浓度1.0×108pfu/mL的噬菌蛭弧菌制剂,有利于提高DO含量及乌鳢存活率,降低NH3-N、NO2--N含量及弧菌总数。     

Application of the rpoS gene for the detection of Vibrio anguillarum in flounder and prawn by polymerase chain reaction

Vibrio anguillarum , an opportunistic fish pathogen, is the main species responsible for vibriosis, a disease that affects feral and farmed fish and shellfish, and causes considerable economic losses in marine aquaculture. In this study, we used polymerase chain reaction (PCR) to detect V. anguillarum . PCR specificity was evaluated by amplifying the rpoS gene, a general stress regulator, in six strains of V. anguillarum and 36 other bacterial species. PCR amplified a species-specific fragment (689 bp) from V. anguillarum . Furthermore, the PCR assay was sensitive enough to detect rpoS expression from 3 pg of genomic DNA , or from six colony-forming units (CFU) mL⁻¹ of cultured V. anguillarum . However, the assay was less sensitive when genomic DNA from the infected flounder and prawn was used (limit of detection, 50 ng and 10 ng g⁻¹ tissue, respectively). These data demonstrate that PCR amplification of the rpoS gene is a sensitive and species-specific method to detect V. anguillarum in practical situations.     

创伤弧菌FJ03-X2胞外产物对欧洲鳗鲡的致病性和免疫原性分析

以70%饱和硫酸铵盐析法制备鳗源创伤弧菌生物1型高致病菌株FJ03-X2的胞外产物(ECPs),攻毒试验表明,该ECPs对鳗鲡无致病力;SDS-PAGE分析表明,该ECPs由约36 ku为主的系列蛋白条带组成。制备ECPs的免疫刺激复合物(ISCOMs),以20μg/尾的剂量腹腔注射免疫规格为15~20 g/尾的欧洲鳗鲡,ELISA分析表明,21 d和28 d时的血清抗体效价约为1∶1 280,免疫印记显示,ECPs中分子量为36 ku以上的蛋白成份可被免疫欧洲鳗鲡血清所识别,是构成ECPs的主要免疫原;免疫保护试验表明,免疫欧洲鳗鲡显示出较高的免疫保护力。试验结果也显示出,单纯以ECPs等剂量腹腔注射免疫欧洲鳗鲡,不能激发欧洲鳗鲡产生较高滴度的血清抗体,免疫欧洲鳗鲡也未能产生有效的保护性免疫应答。     

海马病原菌的分离鉴定及其对抗生素敏感性的研究

从患病海马Hippocampus kelloggi体内分离到3株菌株,用分离菌株的纯培养物感染健康海马,48 h内海马全部发病,其临床症状与原患病海马相似,经形态学、生化和室内感染试验,鉴定该菌株为副溶血弧菌Vibrio parahem olyticus。药敏试验结果表明,所分离菌株对链霉素、利福平、卡那霉素、环丙沙星、氟派酸、四环素、复达欣、菌必治、奈定酸等抗菌药表现为高敏感性;对红霉素、新霉素、先锋霉素Ⅵ、强力霉素、新生霉素、头孢呋肟、呋喃妥因等药物敏感性较高;对氨苄青霉素、羟苄青霉素、头孢氨苄、林可霉素等药物敏感性较差。     

基于转录组测序的半滑舌鳎长链非编码RNA的初步鉴定与分析

以抗病家系与易感家系半滑舌鳎为材料,进行哈维弧菌感染实验,并对易感家系感染前(CsSU)、易感家系感染后(CsSC)、抗病家系感染前(CsRU)、抗病家系感染后(CsRC)4组进行转录组测序,根据RNA-seq数据挖掘半滑舌鳎长链非编码RNA信息;通过生物信息学分析,筛选出与抗哈维弧菌病相关的差异长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。结果显示,共识别出4 584个lncRNA座位,包含5 714个转录本;其基本特征与编码基因的比较分析,lncRNA的GC含量低于编码基因,单外显子基因数多于编码基因,转录本的平均长度长于编码基因,基因表达量低于编码基因。对4组样品进行两两比较(CsRU vs CsSU、CsRC vs CsSC、CsRC vs CsRU、CsSC vs CsSU)分别筛选出818、813、261、140个差异表达lncRNA,其中CsRU与CsSU之间、CsRC与CsSC之间lncRNA数目差异最多,通过聚类分析确定了各实验组的表达模式之间的联系,CsRU与CsSU之间的表达模式最为相近。通过共表达分析,预测出lncRNA和274个编码基因可能存在14 539种相互关系,并进行了功能注释,进而筛选出7个关键lncRNA。qRT-PCR结果显示,差异表达lncRNAs的表达模式和转录组数据得到的基本一致。研究结果为揭示lncRNA在半滑舌鳎抗哈维弧菌免疫调控反应中的作用提供重要的参考数据。