蜡梅快速碱化因子基因CpRALF 的克隆及表达分析

 通过随机克隆测序的方法从蜡梅花cDNA文库中获得快速碱化因子基因,命名为CpRALF（GenBank登录号为：JQ217379）。扩增获得的DNA序列与cDNA序列一致,表明该基因不具有内含子,包含一个384 bp的最大开放阅读框,编码一个长127个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有快速碱化因子特有的YIXY、YXRGC和4个保守的半胱氨酸以及双精氨酸结构。实时荧光定量PCR分析表明该基因在蜡梅茎、根和盛开的全花中表达量较高;在花发育过程中,蕾期和衰败期表达丰度高。在对蜡梅幼苗进行高温、低温、高盐、重金属4种非生物胁迫处理后,通过实时荧光定量PCR对CpRALF在幼叶中的表达量进行分析,结果表明高温、高盐和重金属能够促进该基因表达,而低温则抑制该基因的表达,且CpRALF对高盐与重金属胁迫的响应比对高温和低温胁迫的响应更为显著和迅速,表明该基因可能在蜡梅花发育以及非生物胁迫反应响应方面发挥作用。     

茶树肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆及表达分析

肉桂酸4-羟基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）是茶树苯丙烷代谢途径中的关键酶,能够影响木质素和类黄酮等次级代谢物的生物合成。本文采用5′-RACE技术,克隆了茶树肉桂酸4-羟基化酶基因（CsC4H）的全长序列,其中开放阅读框长1β518βbp,编码505个氨基酸,推测蛋白分子量为58.15βkD,理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到该基因上游1β840βbp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外,还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明该基因在芽、叶、茎、根中都有表达。将该基因重组至表达载体pYES-DEST52上,并在酿酒酵母WAT11中进行真核表达。利用LC-MS方法检测酶反应产物,结果表明目的蛋白能够催化肉桂酸生成p-香豆酸。