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通过PCR扩增的方法从大豆品种Harosoy中克隆到1个新的b ZIP基因(Gmb ZIP71),基因表达分析表明Gmb ZIP71在叶片、生长点、花、花芽、荚和根等多个器官中表达。将Gmb ZIP71构建到原核表达载体p ET29b上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,对其进行IPTG诱导。结果表明:在IPTG浓度为0.25 mmol·L-1,诱导时间为4 h,诱导温度为28℃时,重组蛋白得到表达,分子量大约为48 k Da,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在,用His蛋白纯化系统回收得到Gmb ZIP71-His重组蛋白,EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验表明Gmb ZIP71重组蛋白可以在体外与ACGT顺式作用元件结合。 相似文献
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DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用, 对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA, 采用序列胶分离DNase I酶切片段, 操作较复杂, 分辨率较低, 不适用于高通量的样品检测。为阐明植物体内DREB转录因子的调控机制, 本研究利用改进的DNA酶I足迹法(DNase I Foot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA), 选用荧光色素代替同位素标记, 毛细管电泳技术代替序列胶检测DNase I酶切片段, 判定GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子DNA结合的区域。采用限制性内切酶酶切GmDREB3启动子DNA验证以上结果。同时, 在判定的GmMYB1结合区域的基础上, 选择可能的DNA结合元件与GmMYB1进行EMSA试验, 证明GmMYB1可以与相应元件结合。该方法比传统的DNA酶I足迹法快速、简便、准确并可靠, 作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的DNA结合位点。 相似文献
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【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站(http://smart.embl- heidelberg.de/)进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时(一对真叶期),分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d(12 days post anthesis,DPA)纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验(EMSA)检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b(BoxⅡ)和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d(12 DPA)纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞(EMSA)分析发现,GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。 相似文献
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为了阐明转录激活因子FleQxoo对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)鞭毛基体基因fliExoo的转录调控机理,本研究用PCR方法从Xoo野生型菌株PXO99A中克隆了fleQxoo基因,构建了原核表达载体pET21-fleQxoo,在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中进行了诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化得到FleQxoo蛋白;EMSA检测到FleQ-xoo与鞭毛基体基因启动子fliExoo-p片段的特异结合作用。这些结果为阐明FleQxoo直接调控鞭毛基体基因fliExoo的转录提供了分子证据。 相似文献
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作为重要的植物转录因子家族, AP2/EREBP转录因子在植物发育、激素、病原反应及非生物胁迫如干旱、高盐、低温应答方面起重要作用。本研究发现水稻AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚家族成员OsASIE1 (abiotic stress induced EREBP gene)在水稻受到高盐、干旱胁迫时表达量迅速提高, 并且在水稻中超表达OsASIE1能够改善水稻抵抗盐胁迫的能力。凝胶迁移率实验(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)表明该转录因子的AP2结构域能够结合干旱应答顺式作用元件DRE (dehydration-responsive element)和乙烯应答元件GCC box (ethylene response element), 推测OsASIE1可能通过结合DRE和GCC box 作用元件调控下游相关基因的表达, 进而调控相关抗逆反应。 相似文献
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利用PCR法克隆得到家蚕核型多角体病毒镇江株 (BmNPV ZJ)的iap 1基因。序列同源分析表明 :BmNPV ZJ的iap 1全长为 85 8bp ,与BmNPV T3株的碱基同源性为 96 % ,与BmNPV T3株相比少了一段编码 7个氨基酸的区域 ,该缺失区域的两侧有着独特的结构 :缺失区的 5′侧为连续编码 7个天冬氨酸的序列 ;缺失区的 3′侧为连续编码3个天冬氨酸的序列。NCBI的DART(DomainArchitectureRetrievalTool)功能域搜索表明 ;BmNPV ZJ的iap1含有 2个杆状病毒BIR功能域 ,但不含RING区域。BmNPV的iap是否具有抗凋亡作用迄今尚未见报道。利用以NF κB为探针的凝胶阻滞分析表明 ,BmNPV ZJ的iap1转染鼠的pc12细胞 ,可逆转肿瘤坏死因子TNFα处理pc12细胞引起的核因子 κB(NF κB)的激活。BmNPV ZJ的iap1对NF κB的作用途径及作用方式 ,以及其对哺乳动物细胞的细胞凋亡相关作用的研究正在进行之中 相似文献
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