蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

糖苷水解酶家族基因AghyGH1a参与莲草直胸跳甲对皂苷的代谢

为了解植物化合防御物质皂苷对专食性天敌莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila的防御作用,测定莲草直胸跳甲2龄幼虫取食皂苷后的排泄和肠道变化,利用转录组测序筛选参与皂苷代谢的候选基因,并采用 RNA 干扰技术鉴定候选基因功能。结果发现,取食皂苷导致莲草直胸跳甲幼虫排泄量增加,肠道畸变,排泄量与取食皂苷浓度正相关。转录组测序发现,与对照相比,取食 100 mmol/L皂苷处理的莲草直胸跳甲幼虫肠道有496条差异表达基因,其中261个上调基因和235个下调基因。GO分类和KEGG分类分析发现糖苷水解酶家族1（glycoside hydrolase family1,GH1）基因集中在碳水化合物水解通路。利用RNA干扰技术鉴定发现,莲草直胸跳甲AghyGH1a基因沉默可导致幼虫取食皂苷后排泄量增加,肠道内容物颜色更暗沉。表明莲草直胸跳甲AghyGH1a参与皂苷代谢。     

有机磷水解酶及其细胞表面展示研究进展

对有机磷水解酶在酶学特性、蛋白结构和细胞表面展示等方面的研究进行了综述,并且对该领域的研究趋势进行了展望。     

Cloning and Expression of Bile Salt Hydrolase Gene from Lactobacillus plantarum M1-UVS29

We cloned and expressed bile salt hydrolase gene of Lactobacillus plantarum M1-UVS29 in Lactococcus lactis NZ9000 successfully. Gene-specific primers for amplification of L. plantarum bsh were designed by using sequence which availabled from Gen Bank. The production of PCR amplicon was confirmed by sequencing and cloned into pMD18-T vector, and then recombined into expression vector p NZ8148 and yielding vector p NZ8148-BSH. p NZ8148-BSH was transferred into Lactococcus lactis NZ9000. Sequencing indicated that the cloned bsh fragment contained 995 nucleotides, and shared 99.3% sequence homology with bsh gene from L. plantarum MBUL10. Cloned bsh fragment was successfully transduced into NICE expression system and confirmed by PCR and restriction digest. Recombinant BSH protein was analyzed by SDS-PAGE. The molecular weight of BSH protein was approximately 37 ku. Activity of the expressed protein was 0.77 μmol · min-1. The successfully expressed proteins by genetic engineering technology made the function of lactic acid bacteria be abundant and laid the foundation for further researches into cholesterol-lowering lactic acid bacterium food and probiotics.     

猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析

从人泛素C端水解酶L1(UCH_L1)基因出发,在dbEST数据库中同源搜索,找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST(BM194679).通过电子克隆和进一步RT-PCR试验验证,获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列,其全长 1 105 bp,开放阅读框(ORF)位于60～728 bp,编码223个氨基酸.同源性分析结果表明,与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为91.2%和86.5%,蛋白质序列同源性均为96.6%.对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域,不含有信号肽,存在1个UCH_L1(pfam01088)保守结构域和多个磷酸化位点,属UCH_L1蛋白家族,故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因(登录号AY495532).     

温度对麦秸混合物料厌氧干发酵中糖类水解酶活性的影响

水解酶活性直接影响到秸秆厌氧干发酵的沼气产量。本文以麦秸为主要原料, 配制干物质含量(TS)35%的混合发酵物料, 设置20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃ 5种不同温度条件, 发酵周期为35 d, 测定发酵过程中料液的纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和蔗糖酶的活性变化。结果表明, 沼气产气高峰在35 ℃左右, 20~40 ℃时, 随着温度的升高, 发酵后料液的料液干物质含量(TS)、可挥发固体含量(VS)、C/N均明显下降, 发酵产沼气后, 各处理发酵液 pH都降到7.0以下, 其中40 ℃的pH降低幅度最大。纤维素酶活性在发酵初期较低, 峰值出现也较晚, 温度升高明显有利于提高纤维素酶活性。木聚糖酶的起始活性较高, 整个发酵过程中呈先升高后降低并渐趋于平缓的变化趋势, 20~25 ℃处理的木聚糖酶活性在整个发酵过程中没有明显峰值。淀粉酶的起始活性较低, 但随后迅速升高, 30~40 ℃处理在10 d左右达到峰值后开始下降, 此后酶活力的变化幅度较前期平稳。蔗糖酶的起始酶活力较低, 随后升高迅速, 温度在30 ℃以上时酶活性增加更快, 35 ℃时15 d达到峰值后迅速下降, 下降速度明显大于30 ℃和40 ℃处理。由此可见, 温度对秸秆厌氧干发酵过程中不同水解酶活性的影响还是有所差异的。     

细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacterium sp.)的有机磷水解酶基因(opd 构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体Pymbp,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd.SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质.重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100 μmol/L Go2 培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg.用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%.重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活.     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

圆叶决明添加量对红壤可溶性氮及酶活性的影响

为了探明圆叶决明(Chamaecrista rotundifolia)降解后红壤可溶性氮及氮水解酶活性的变化规律,本研究采用室内好气恒湿培养法,研究占红壤质量0.5%(T1),1%(T2)和2%(T3)的圆叶决明添加至红壤中,培养7~88d内红壤硝态氮(NO^-₃-N)、铵态氮(NH⁺₄-N)和可溶性有机氮(Soluble organic nitrogen,SON)及脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶的变化。结果表明：添加圆叶决明后,红壤NO^-₃-N和NH⁺₄-N含量在培养前期降低,培养中期增加;而整个培养期SON含量及脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶活性均增加,且圆叶决明添加量越大,效果越显著。NO^-₃-N和SON含量及脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶活性可用2次或3次函数方程拟合;而NH⁺₄-N含量可用线性函数拟合。氮水解酶与NO^-₃-N负相关,与NH⁺₄-N和SON正相关,且相关性从大到小的顺序为蛋白酶>天冬酰胺酶>脲酶。综上,添加圆叶决明提高了红壤供氮水平和红壤氮转化能力。     

水解类酶活性在农业废弃物静态高温堆腐过程中的变化

在静态通气条件下,以养鸡场鸡粪、小麦秸秆为原料,研究了堆腐过程水解类酶活性、pH值、电导率（EC）变化。结果表明,加入微生物菌剂后纤维素酶、蔗糖酶活性在堆腐过程中的变化趋势同CK处理（不加微生物菌剂）基本一致,但两种酶的活性高峰值都高于CK处理,其峰值分别达到了glucose 0.457mg/(g·24h)和glucose 87.836mg/(g·24h),两种酶高峰值的出现均早于CK处理,其中纤维素酶活性高峰值较CK处理提前出现2d,蔗糖酶活性高峰值较CK处理提前出现6d;加入微生物菌剂能提高脲酶活性水平及其峰值;加入微生物菌剂处理的pH值相对较低,变化幅度较小;加入微生物菌剂后EC值较高。