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[目的]构建广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体并对其靶基因进行预测及相关通路分析,为揭示miR-148b的作用机制打下基础.[方法]以广西巴马小型猪血液基因组DNA为模板,扩增miR-148b的前体及部分侧翼序列,使用T4连接酶将目的片段连接至pLV-CMV-MCS-EF1载体上,构建获得pLV-miR-148b慢病毒表达载体;以pLV-miR-148b慢病毒表达载体转染293T细胞48 h后进行表达验证;利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大数据库预测分析广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,并以MirPath v.3分析miR-148b靶基因相关通路.[结果]广西巴马小型猪miR-148b片段大小为385 bp,与miRBase 21.0网站上已发布猪miR-148b成熟序列(前体和侧翼序列)的同源性达100%.构建获得的pLV-miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,且相对表达量极显著高于pLV-GFP慢病毒空载质粒转染组(P<0.01).数据库预测分析得到18个广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,分别为CLOCK(时间昼夜调控因子)、MIER1(转录调控因子)、MECP2(甲基化CpG结合蛋白)、ZNF704(锌指蛋白)、SPTY2D1(SPT2染色质蛋白)、QKI(RNA结合蛋白)、ZBTB20(锌指蛋白)、MGAT4A(钠/磷酸转运蛋白)、UHMK1(编码蛋白激酶)、PIK3C2A(磷酸肌醇-3-激酶2α肽)、C6orf62(6号染色体开放阅读框62抗体)、HECW2(E3泛素蛋白连接酶)、MAP1B(微管相关蛋白)、NHS(NHS肌动蛋白调节因子)、B4GALT6(β-1,4-半乳糖基转移酶)、ATP2A2(肌浆ATP酶/内质网Ca2+转运酶)、AP4E1(蛋白复合物接头分子)和BBX(锌指蛋白);且发现有11条靶基因相关通路,其中与疾病相关的通路有脂肪酸合成通路、细胞外基质受体相互作用通路、癌症的蛋白聚糖通路、神经胶质瘤通路、癌症的小分子核糖核酸通路、肾细胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路.[结论]广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,miR-148b存在18个靶基因和11条相关通路,且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相关疾病通路上发挥作用. 相似文献
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《中国兽医杂志》2015,(11)
运用点突变试剂盒构建pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163真核表达载体,脂质体介导YFP-H148Q/V163S转染稳定表达Ano1的FRT细胞,荧光淬灭动力学试验检测YFP-H148Q/V163S对其氯离子的敏感性。测序结果显示,YFP(yellow fluorescent protein)特异编码序列上第508-510位碱基CAC突变为CAG,148位组氨酸H突变为谷氨酰胺Q;第553-555位碱基GTG突变为AGC,163位缬氨酸V突变为丝氨酸S。荧光淬灭动力学试验结果显示,向表达YFP-H148Q/V163S的FRT细胞加入Anol激活剂ionomycin和Cl~-,其相对荧光强度明显下降。pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163真核表达载体成功构建,并证实表达于FRT胞浆中的YFP-H148Q/V163S具有对氯离子敏感的特性。 相似文献
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荆楚优148是用优质不育系荆楚814A作母本,恢复系R148作父本配组选育而成的杂交晚稻新品种,2002年通过湖北省品种审定,2006年通过国家品种审定。介绍了该品种在江汉平原的种植表现及高产栽培技术。 相似文献