胚胎干细胞及种系嵌合体的研究进展

胚胎干细胞是着床前的囊胚内细胞团或早期胎儿的原始生殖细胞经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系 ,具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化潜能 ,体外培养时保持未分化状态 ,可以传代增殖。改变维持胚胎干细胞不分化的培养条件 ,胚胎干细胞可自发分化成多细胞结构。在一定诱导下 ,胚胎干细胞可向多个方向分化 ,并生成多种功能细胞。胚胎干细胞注入到胚泡期胚胎或与桑椹期胚胎聚合 ,可以参与包括性腺在内的各种组织的嵌合体的形成。胚胎干细胞在细胞分化与调控 ,胚胎发育 ,遗传病 ,肿瘤 ,免疫和组织或器官移植等研究中显示着广泛的应用前景。而种系嵌合体的获得是实现 ES细胞途径的决定步骤 ,低的种系嵌合率则是制约 ES细胞应用的关键。提高供体 PGCs在受体生殖腺中的比例 ,缩短 ES细胞的体外培养时间 ,以及注入早期发育阶段的受体胚胎等都能提高种系嵌合率。文章从多个方面综述了胚胎干细胞的最新研究成果 ,并着重以禽类 ES细胞为例论述了种系嵌合体的检测方法 ,种系嵌合率的影响因素以及提高种系嵌合率的方法     

猪原始生殖嵴细胞(PGCs)建系因素的研究

从五指山猪(WSZP)近交系第8～13代培育群中，先后选用21头5～10月龄青年母猪，分别于授精后25～30d采集胎儿106个，进行原始生殖嵴(PGCs)细胞分离、培养等建系技术研究。以DMEM F10(1:1)为基础培养液，按添加或不添加生长因子，将培养液分为A、B、C3种，并以STO细胞作饲养层，在38℃、5.0％CO2和湿润的气相中进行培养建系。结果获得胚胎生殖嵴细胞(EG)细胞系6个细胞株，其中1个EG细胞株传至11代、2个传至5代、1个传至4代、2个传至3代冻存。并进行了AKP染色、体外分化、冷冻-解冻复苏和嵌合体制作等鉴定研究。研究发现：不同胚龄对EG细胞建系具有一定影响，不同培养液对EG细胞建系效果不同，STO细胞饲养层的质量是建株、传代、冷冻-解冻复苏的关键因素之一。EG细胞系的初步建立，为今后筛选进入种系的EG细胞系、实施体外基因操作提供了可能。     

狼山鸡-AA肉鸡嵌合体的制作及其转基因鸡研究

试验Ⅰ:以狼山鸡为供体,AA肉鸡为受体,通过赤道开窗法制作了狼山鸡-AA肉鸡的嵌合体.共操作了108枚鸡蛋,孵化成活19只,孵化成活率17.6%.获得表型嵌合体鸡胚22枚,其中15只孵化成活,嵌合体率为13.9%.对2只嵌合体公鸡解剖发现,有1只的睾丸发育异常.PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,2只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞.结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因鸡是可行的.试验Ⅱ:利用脂质体介导法,在体外将外源pEGFP质粒转入到鸡X期胚胎细胞中,培养8 h开始有外源基因的表达,体外培养12 h后获得了21.43%的转染效率.将转染后的鸡胚盘细胞移入到受体AA肉鸡的胚下腔,孵化6 d后在8个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为40%(8/20).     

利用茎尖离体嫁接获得大蒜体细胞嵌合体的研究

以‘阿城紫皮’大蒜和日本‘福地六瓣’白皮大蒜鳞茎茎尖为接穗、鳞茎盘为砧木,利用离体茎尖微体嫁接技术,研究了大蒜体细胞嵌合体的培育,用RAPD分子标记技术进行了嵌合体的鉴定。结果表明：最佳生芽培养基为MS+NAA 0.1 mg·L^-1+2ip 0.4 mg·L^-1;最佳生根培养基为1/2 MS + IBA 1.5 mg·L^-1。嫁接成活率达16.00%~26.67%。利用引物OPF-16鉴定表明白/紫、白·紫/紫、白·紫/白、紫/白4种嫁接方式获得了嵌合体。利用引物OPJ-12鉴定表明紫/白嫁接方式获得了嵌合体,而引物OPE-05鉴定未能检测出亲本与嫁接苗之间的差异。     

柑桔嫁接嵌合体--澧州红脐橙

澧县地处湖南省北部，素有“鱼米之乡”之称，属中亚热带向北亚热带过渡的季风湿润气候，年平均气温16．5℃，雨量1272mm，年日照时数1771h，无霜期为265d。由于常受灾害性天气的影响，又不是脐橙的适宜生态区，澧县生产的脐橙品质和产量都不及适宜区。为选育抗寒、优质、高产的脐橙新品种，我所于1995年成立了专题研究组，对澧县脐橙进行全面普查，开展选优工作。2000年11月中旬，在一户农家改接脐橙园中发现一变异枝，后经中国农科院柑桔研究所、湖南省农科院园艺研究所、湖南农业大学等单位的专家鉴评，认为“系桔橙嫁接嵌合体，且遗传性稳定，该品种的问世对改变北亚热带及脐橙产区品种结构和优化脐橙生产具有积极推动作用。”由于该品种果形似脐橙，故暂定名为“澧州红脐橙”，简称“澧州红”。     

芙蓉鲤鲫(芙蓉鲤♀×红鲫♂)的性腺组织学及繁殖性能研究

采用解剖观察、组织切片及人工催情等方法,研究芙蓉鲤鲫(Cyprinus capiofurong.♀×Carassius auratus red var.♂)的性腺发育及繁殖性能。结果显示:解剖观察,芙蓉鲤鲫性腺发育异常的个体占83.64%,性腺外观基本正常的个体占16.36%。组织学观察,芙蓉鲤鲫性腺可分三类:两性嵌合体占21.13%,其中以精巢为主的16.90%,以卵巢为主的4.23%,它们性腺发育迟缓,在繁殖季节成熟系数也没有明显变化,性腺多为一侧发育或两侧不对称,两种性腺细胞均不能成熟;雌性个体占40.84%,在生殖季节卵巢可发育到第IV时相,但未见其细胞核发生偏移;雄性个体,占38.03%,在生殖季节只能发育到精子细胞阶段,不能产生成熟的精子。经人工催产,芙蓉鲤鲫少部分个体有发情产卵行为但不能正常受精。结果表明芙蓉鲤鲫为两性败育类型。     

转基因鱼品系的纯化

外源基因(双链DNA)作为外显子可能整合在一条染色体上的不同DNA链上,转基因鱼的第一代为嵌合体。三杂交纯化过程方可获得转基因鱼纯合体:嵌合体与纯系个体两次回交,获得杂合子单一的杂合体;第二代杂合体自交可以获得纯合体。     

红江橙嵌合特点的扫描电镜观察

以嫁接嵌合体红江橙为材料，在扫描电镜上观察了红江橙及其分离出来的４种变异类型的叶、果表面及其切面的结构．结果表明，红江橙的叶面与其分离出来的黄肉果和橘变果有较大差异，红江橙果皮切面海绵层介于黄肉果与橘变果之间，而从果皮的切面发现表皮层的细胞排列紧密，体积较小，呈长形方格状，与紧接其下的海绵层具有较大的、圆形蜂窝状的细胞明显可分．作为同质体的黄肉果和橘变果，则未能观察到这种结构差异     

用过氧化物同工酶分析改良橙果实的嵌合结构

改良橙是印子柑和红桔嫁接嵌合的甜橙良种，试验根据改良橙不同果实形态特征，分析了红肉果、黄肉果和红黄肉嵌合果实的汁胞、油胞层和白皮内层的过氧化物中酶谱，并以印子柑、福桔等柑桔品种相应组织的酶谱为对照进行比较。