我国科学家开发出“抗除草剂水稻”

通过除草剂抗性筛选,成功鉴定出4个自然界中未曾被发现的、对除草剂具有不同抗性程度的新等位基因。近日,中国农业科学院植物保护研究所周焕斌团队提出并应用单碱基编辑技术介导的植物内源基因定向进化技术,开发出具有除草剂抗性的水稻新种质,助力农作物精准分子育种。     

枯草芽胞杆菌ZJF-1A5的β-葡聚糖酶热稳定性改造及酶学性质分析

利用定向进化技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ZJF-1A5的β-葡聚糖酶基因进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。获得了2株可以产较高热稳定性酶的突变体,分别被命名为EGs1和EGs2。酶学性质分析结果显示,与野生酶相比,EGs1和EGs2突变酶的半失活温度分别提高了3和5℃,达到了65.5和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃,达到了60℃;2个突变酶对地衣多糖的水解能力分别提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力未见改变;野生酶和EGs1突变酶最适pH6.5,而EGs2突变酶最适pH7.0;野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH6.0～8.5的范围内放置48h,仍保持80%以上的酶活力。遗传稳定性检验结果表明,突变株的遗传稳定性良好。     

转座酶Tn3体外定向进化和酶活力提高方法的建立

试验旨在对转座酶Tn3的酶活力提高和进化进行初步探索。采用PCR扩增、限制性酶切、DNA连接、重组质粒的转化、易错PCR的优化及构建、D值的测定、酶切鉴定方法对转座酶Tn3进行体外定向进化研究。结果表明,用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒进行酶切,得到了450 bp的酶切产物;在含有卡那霉素的LB培养基培养菌体24 h,测量其D值,经过3轮重复性的研究,其D值和增殖能力从开始的0上升至0.18、0.42、0.60,说明Tn3活性有了明显的提高;将筛选得到的进化型重组质粒进行质粒抽提,用内切酶XhoⅠ和XbaⅠ进行双酶切鉴定,发现进化型重组质粒酶切产物条带相对较小;之后对进化型重组质粒进行基因测序分析,发现Tn3基因序列的多个位点发生了突变以及Tn3-Gal4靶向序列中间的CCR5-delta32基因被切除。说明成功完成了转座酶Tn3基因的克隆;确立了易错PCR的最优反应体系;选择卡那霉素作为筛选标记对进化型Tn3进行筛选,初步验证利用含有卡那霉素的LB培养基和对菌液D值的测定来进行筛选是可行的;Tn3基因序列突变和基因敲除,说明不论是在功能上还是在基因序列上Tn3都发生了改变,这种变化正是向着需要的方向进行的。     

羧酸酯酶BioH的克隆表达及其水解活性的定向进化

通过分子克隆手段获得大肠杆菌来源的羧酸酯酶BioH,采用定向进化的方法提高该酶的水解活性以提升其应用价值.通过PCR扩增,从大肠杆菌K12菌株中克隆得到羧酸酯酶BioH基因,目的基因长度为771bp,含256个氨基酸;将其连接到pET30a(+)质粒上并转入BL21(DE3)宿主细胞中,经诱导表达得到所需的目的蛋白,该蛋白分子质量约为28.2ku.野生型的BioH水解对硝基苯丁酸酯(p-NPB)的活性为18U/mg,且该酶具有良好的热稳定性.以p-NPB为底物进行高通量筛选,其水解底物为对硝基苯酚(p-NP),在405nm处有最大吸收峰.挑选出水解活性提高的突变体,并通过2轮定向进化过程,成功筛选到7个水解活性提高的优良突变体,它们的活性分别提高了20%~100%.结构分析表明,突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置.     

高通量筛选蛋白质突变体库方法的研究进展

定向进化已经被广泛用于修饰和加强蛋白质性能的研究。蛋白质突变体库筛选方法的改变和完善进一步加强了定向进化技术在理解和设计新蛋白质实验中的运用。近年来报道了许多新的高通量筛选方法。这些方法已经越来越多地用于蛋白质工程的研究，并且解决了此领域中一些具有争论性的前沿问题。     

蛋白质定向进化的高通量筛选方法

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。     

酶的定向进化方法和应用

文章综述了随机突变、基因重组等策略的进展，该项技术在改进酶各种性质的应用，使酶在医学、工业、食品业、农业等方面具有了广阔的前景。     

一种用于高效筛选极端酶突变基因的质粒营救法

为简化定向进化筛选突变耐高温和耐酸碱酶等极端酶的繁复工作,建立了一种快速质粒营救法,可直接从加热处理的平板中回收携带有突变基因的质粒,用于进一步的随机突变基因的筛选和基因测序等.研究了在不同的热处理条件下的质粒营救效率,获得了质粒营救转化效率最高的处理条件.结果表明,本方法适于质粒大小在2～10 kb范围的载体,可用于平板筛选最适酶活性温度在60～100℃、pH 4～10的突变体酶,并可将一轮的筛选过程缩短1～2 d.     

酶的定向进化及其应用进展

酶的定向进化是用于改良酶特性的一种策略,主要包括构建酶突变文库和高通量筛选。目前,突变文库的构建手段主要有随机突变、半理性设计和DNA改组;高通量筛选方法主要分为体内筛选和体外筛选。该文介绍易错PCR、半理性设计、DNA改组、表面展示、核糖体展示和差示荧光扫描等相关技术及其应用情况。