丹参中丹参酮提取工艺优化及活性研究

采用超临界CO2提取法对丹参中丹参酮的提取工艺进行优化。通过液质联用法(LC-MS)对丹参粗提物进行成分分析,鉴定出丹参提取物中的4种主要成分分别为丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮和二氢丹参酮;采用了AKTA纯化系统对丹参粗提取物进行进一步的分离,利用高效液相色谱(HPLC)鉴定4种丹参酮纯度分别为:丹参酮IIA96.685%,丹参酮I93.083%,隐丹参酮94.968%和二氢丹参酮99.621%。CFU实验和MIC试验结果表明,4种丹参酮均表现出不同程度的抑菌效果,其中隐丹参酮的抑菌能力最强。选用丹参中含量最高的活性成分丹参酮IIA作为抗癌活性研究对象,抗癌活性实验中经过流式细胞仪检测,证明丹参酮IIA-P188具有抑制癌细胞生长的作用,且抗癌活性随药物浓度上升而提高。     

丹参的高产栽培及加工技术

主要介绍了丹参的高产栽培方法及其采后炮制工艺对有效药用成分丹参酮IIA的影响。     

干涉丹参SmORA1对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响

【目的】乙烯响应因子（ethylene response factor,ERF）是植物特有的一类转录因子,普遍参与植物各类胁迫反应。前期从药用植物丹参（Salvia ）中筛选得到了一条与长春花（Catharanthus roseus）中CrORCA3高度同源的ERF转录因子编码基因（命名为SmORA1）。论文旨在通过干涉丹参SmORA1的表达,进一步明确SmORA1在植物抗病反应与丹参酮合成代谢调控中的作用miltiorrhiza侵染后转基因株系中丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase,PAL）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase,SOD）等抗性相关酶活性和还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）、脯氨酸（proline,Pro）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量等抗性相关生理指标的变化;采用HPLC法考察干涉SmORA1表达对二氢丹参酮、隐丹参酮和丹参酮ⅡA等丹参酮类次生代谢物含量的影响;采用实时定量PCR考察干涉SmORA1对丹参株系抗性基因和丹参酮合成相关关键酶基因表达的影响。【方法】扩增SmORA1基因片段,构建SmORA1基因干涉载体pk-ORAi并采用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参,经抗生素抗性筛选和PCR鉴定获得阳性转基因丹参植株;采用分光光度法或酶联免疫方法检测立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。【结果】经抗生素和PCR筛选获得了11个阳性株系,进一步采用实时定量PCR分析得到3个SmORA1表达显著下调的转基因株系（RNAi-11、RNAi-18、RNAi-22）,干涉效率达到80%以上。立枯丝核菌对丹参植株有明显的致病力,可以有效诱导丹参发病;其侵染后,SmORA1-RNAi转基因株系病情指数显著高于野生型（WT）和空载（VK）对照株系,病情更严重;SmORA1-RNAi转基因株系中的MDA含量显著高于WT和VK对照株系,说明干涉SmORA1的丹参株系抗衰老能力显著下降;植物抗性相关的PAL、CAT和SOD等酶活性以及GSH和Pro等物质含量显著低于对照株系,说明干涉SmORA1的丹参株系抗病性也呈现明显减弱;进一步研究发现SmORA1-RNAi转基因株系中抗病性相关蛋白编码基因SmPDF1.2、SmSTH-2和SmPR-10的表达量明显低于对照株系。采用HPLC方法分析发现,丹参SmORA1干涉株系中丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量显著下降;同时采用实时定量PCR检测分析,发现丹参SmORA1干涉株系中丹参酮合成途径关键酶基因SmHMGR1、SmHMGR2、SmGPPS、SmGGPPS1和SmGGPPS3等表达显著下调,说明SmORA1可能通过调节SmHMGR1、SmHMGR2、SmGPPS、SmGGPPS1和SmGGPPS3等丹参酮合成途径关键酶基因的表达参与丹参酮类化合物的合成调控。【结论】丹参SmORA1参与了丹参抗病反应,而且与丹参酮类次生代谢物质的合成密切相关。     

多指标优选丹参提取工艺研究

优选丹参中丹酚酸B和丹参酮类的最佳提取工艺。以丹酚酸B和丹参酮类包括丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ和隐丹参酮为综合评价指标,采用单因素试验和正交试验考查溶剂体积分数、溶剂倍数、提取温度、提取时间对提取工艺的影响。最佳提取条件为6倍量70%乙醇在80℃下提取3次,每次2 h。稳定性研究和中试验证结果表明所得工艺合理可行,可作为丹参中丹酚酸B和丹参酮类的提取工艺。     

总丹参酮超声提取及其主要成分的HPLC法测定

[目的]提取总丹参酮并测定其中3种主要成分的含量。[方法]运用超声技术提取总丹参酮,并对提取物中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量进行HPLC测定。[结果]总丹参酮提取物中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA成分完全分离,含量分别为100.4、69.9和124.4 mg/g。[结论]HPLC法简便快速,稳定可靠,对总丹参酮提取物的质量控制具有一定的参考价值。     

丹参酮ⅡA不同生育时期动态积累规律研究

为了解丹参酮ⅡA的积累规律,初步探索其合成机理。本研究选用7份丹参材料,测定了其不同生育时期丹参酮ⅡA含量及相对应的叶片中的叶绿素含量及过氧化物酶活性。结果表明：按照丹参酮ⅡA含量0.2%为标准,不同材料丹参酮ⅡA的积累规律略有不同;根中丹参酮ⅡA含量与相对应的叶片中的叶绿素a含量显著相关（rca＝0.458）,与类胡萝卜素含量极显著相关（rxc=0.623）,而与叶绿素b含量不相关（rcb＝0.069）;根中丹参酮ⅡA含量与相对应的叶片中POD酶活性的相关系数为0.577,呈现极显著相关性。花期丹参酮ⅡA含量有无下降现象与丹参酮ⅡA的合成效率有关;推测丹参酮ⅡA的合成途径的起始步骤可能与类胡萝卜素的合成更为类似,部分基因也与叶绿素a的合成相关基因相类似,与叶绿素b的起始步骤相差较远;丹参酮ⅡA可能与植物体内的生长素氧化有关,而POD可能也间接或直接参与了丹参酮ⅡA的合成调控。     

基于高通量转录组测序初步揭示丹参根和叶中丹参酮和丹酚酸含量差异的分子机制

丹参的药用部位为干燥根及茎,叶片不作为药用部位。为了解析丹参不同组织部位药效的差异,本研究使用Illumina高通量测序平台完成丹参药用部位根和非药用部位叶的转录组测序和功能注释,分析比较了根和叶中的差异表达基因,并进行基因的深度挖掘。本研究共获得54.17 Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到8.29 Gb以上,Q30碱基百分比在94.37%以上。共检测到表达基因32700个,其中已知基因25607个,新基因7093个;表达转录本共56230个,其中已知转录本24627个,新转录本31603个。根和叶中差异表达基因有6959个,其中3265个基因上调表达,3694个基因下调表达。对丹参酮生物合成通路(二萜代谢通路map00904)和丹酚酸生物合成通路(苯丙烷代谢通路map00940)上差异基因分析,分别获得2个差异表达的PAL基因和2个差异表达的CPS基因,这些差异表达基因可能与丹参酮、丹酚酸主要在丹参根中积累有关。本研究结果为参与丹参酮和丹酚酸生物合成功能基因的挖掘、药效物质次生代谢途径解析提供了丰富的信息。     

酵母激发子与水杨酸Ti转化的丹参组培物内源激素含量的影响

Ti转化的丹参组培物在MS－HN4培养基（MS中不含硝酸铵，含蔗糖30g.L^-1)上经25度暗培养18d，生长量由大到小依次为：对照（CK），200umol.L^-1水杨酸（SA），4g.L^-1酵母激发子（E）和E＋SA处理，其中CK和SA处理的组培物仅产生痕量的丹参酮类物质，而E和E＋SA处理的总丹参酮产量分别增加到12．23mg.L^-1和15．07mg.L^-1，表明E处理能促进组培物产生丹参酮类物质，而A可以强化E的这种作用，与上术差异有关的内源激素变化是：培养6－18d ,E SA处理的ABA和iPAs含量均持续高于对照，分别增长了2．8－9．8倍和3．6－5．8倍，而A1＋3和IAA 含量分别比对照降低13．2％－56．9％和34．8％－74．6％，高水平的ABA和iPAs及低水平GA1＋3和IAA抑制了组培物的生长，有利于促进丹参酮产量的提高。     

丹参酮乳房注入剂中有效成分含量测定

采用高效液相色谱测定丹参酮乳房注入剂有效成分隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量。将供试品用正己烷萃取后挥干,甲醇溶解后检测;采用反相高效液相色谱,ZORBAX SB-C18键合硅胶柱(4.6×250 mm,5μm);柱温30℃;流动相为乙腈(A)-0.026%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~20 min:V(A)60→90,V(B)40→10;20~30 min:V(A)∶V(B)=90∶10);流速1.2 m L/min;检测波长270 nm。丹参酮乳房注入剂中隐丹参酮含量在500~1750μg/g(r=0.9999)范围内线性关系良好,平均加样回收率为101.15%,RSD为1.55%;丹参酮ⅡA的含量在1125~3937.5μg/g(r=0.9999)范围内线性关系良好,平均加样回收率为100.89%,RSD为1.64%。结果显示,该方法简单、准确、灵敏,精密度、重复性好,可作为丹参酮乳房注入剂中有效成分含量测定的参考方法。     

中药有效成分丹参酮IIA、三七总苷与阿司匹林抗结直肠癌机制的研究现状及展望

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,并且其发病率呈逐渐升高的趋势。大量研究发现阿司匹林具有降低结直肠癌发生率的可能,而最新研究发现在具有活血化瘀的中药丹参及三七的提取物丹参酮ⅡA及三七总苷也发现了同样的疗效,因此本文就阿司匹林、丹参酮ⅡA及三七总苷抗结直肠癌的机制研究作一综述,以期为其下阶段研究和开发提供参考。