基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。     

CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20 bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。     

芸薹属作物TT8基因鉴定与生物信息学分析

为探明芸薹属作物TT8基因的序列特征和基因组组成,以拟南芥TT8基因为种子序列,利用BLAST工具对芸薹属作物（白菜、甘蓝、甘蓝型油菜、芥菜、黑芥）TT8同源基因进行系统鉴定,对其核苷酸和氨基酸序列进行比较分析。结果表明：在芸薹属作物中共鉴定出7个AtTT8同源基因,其中甘蓝型油菜2个、白菜1个、甘蓝1个、芥菜2个、黑芥1个。芸薹属作物7个TT8基因的基本理化性质、亚细胞定位和蛋白三级结构等均无明显差异;氨基酸序列高度相似,均属bHLH超家族,其中甘蓝型油菜两个TT8同源拷贝分别同白菜与甘蓝聚为一类,亲缘关系紧密;sgRNA分析获得了4条在7个AtTT8同源基因中均高度保守存在的sgRNA位点,推测与TT8基因功能高度相关。最后,本研究还分析43份甘蓝型油菜种质材料的重测序数据,在甘蓝型油菜TT8两个同源基因中共检测到11个多态性位点,包括4个SNP和7个InDel,总频率分别为0.00109和0.00199,均位于5'UTR区。     

CRISPR/Cas9系统介导大鼠Inhba基因的编辑

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点,通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sgRNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。     

基于CRISPR/Cas9技术构建猪miR-136基因编辑载体

为了阐明microRNA对猪产仔数的调节机制,采用CRISPR/Cas9技术构建针对猪miR-136的基因编辑表达载体。通过实验,在miR-136基因成熟区及其下游设计两个单链引导RNA(sgRNA),合成4条磷酸化的单链DNA寡核苷酸,复性后形成两条带粘性末端的双链寡核苷酸片段,插入线性化的载体pX462的BpiI酶切位点处,转化感受态大肠杆菌DH5α,经测序确认,得到两个编辑表达载体pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。构建了两个编辑miR-136基因的表达载体,为猪繁殖力的调控研究奠定了技术基础。     

基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白体DNA定点内切酶体外活性建立高效基因型分析技术

建立快速、准确、高通量与简便易行的基因型分析技术对基因功能解析、分子育种与突变体鉴定研究具有重要价值。本研究的目标是利用Cas9或Cas9NG变体与单分子指导RNA (single guide RNA, sgRNA)核糖核蛋白复合体(sgRNA/Cas9-RNP或sgRNA/Cas9NG-RNP)体外DNA定点内切酶活性,建立与优化简便高效与低成本的基因型分析技术。以我们前期创制的CRISPR/Cas9定点编辑玉米ZmWx基因第7外显子区域定点突变基因编辑后代分离群体为材料,以ZmWx靶位点两侧特异引物扩增的PCR产物为底物,利用原核表达并纯化的Cas9或Cas9-NG蛋白为DNA内切酶,以体外转录的靶向ZmWx基因靶点的sgRNA或骨架序列优化的sgRNA(enhancedsgRNA,esgRNA)为Cas9或Cas9-NG酶定点活性指导元件,通过体外组装为sgRNA/Cas9-RNP复合体,对目标样本迚行酶切,以区分目标位点野生型、纯合突变体、杂合突变体基因型,并对反应体系迚行了优化。研究表明,基于esgRNA/Cas9的PCR/RNP检测技术可对ZmWx基因编辑目标突变体后代迚行...