寨卡病毒SYBR GreenⅠreal-time PCR方法的建立及应用

为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×10^1 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1%,重复性好。本研究建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断。     

两种一步法RNA提取试剂的比较

RNA的提取在生物医学研究和临床检测上应用广泛。本文分别用进口Invitrogen公司生产的以及我们自己研制的一步法RNA提取试剂，提取大肠杆菌RNA、鸡肌肉组织RNA和尿囊液RNA，通过核酸电泳和荧光定量RT-PCR进行比较。结果表明用我们自己研制的和进口的试剂提取的RNA都不含有DNA；这些RNA都可以作为模板进行RT-PCR检测，并且在数量上相互之间没有明显差异。说明我们自己研制的一步法RNA提取试剂可以取代进口试剂。此外，本文还讨论了此类试剂一些评定方法。     

计算机视觉在脱水姜片在线分选中的应用

目前,脱水姜片的分选主要靠人工完成,分选精度不高,结果不稳定.为此,研究设计了一套基于计算机视觉的在线分选装置;开发了基于物料颜色参数的实时算法,对物料图像进行特征提取和一系列处理;运用双缓冲技术提高系统运行速度.试验结果表明,分选出的成品中含有的合格姜片达到95.5%,系统测量速度快、分选精度高且运行稳定,满足在线实时分选要求.     

应用多重荧光PCR快速筛查作物中转基因成分研究

通过对我国批准进口的和获得农业转基因生物安全证书的转基因玉米转化体的序列分析发现,除DAS40278-9和BLVA430101外,CaMV35s启动子、NOS终止子、CrylAb/Ac基因和pat基因覆盖了 21种玉米转基因转化体.通过引物组合筛选、反应体系优化、灵敏度测试、适用性测试等实验,建立了基于4个通用筛选元件...     

烟粉虱模式识别受体βGRPs的先天免疫应答

为探索烟粉虱的β-1,3-葡聚糖识别蛋白(BtβGRP)在烟粉虱先天免疫过程中的重要作用,对烟粉虱中鉴定的3个BtβGRPs基因编码的蛋白质进行结构分析,并与其它物种的23个同源蛋白进行系统进化分析,同时通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测分析球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态不同时间点后BtβGRPs的时间表达模式。结果显示:经鉴定3个BtβGRPs蛋白序列均含有βGRP家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域;且3个BtβGRPs独自聚在进化树的一支上,可能参与烟粉虱特有的级联路径;3个BtβGRPs基因在不同虫态和不同诱导时间点与对照相比,除BtβGRP3在卵期未表达外,均有上调表达趋势,但诱导程度不同;成虫诱导24~36 h后达到峰值,比卵和若虫稍晚,可能是由于烟粉虱成虫体表有白色蜡粉等物质,延迟了球孢白僵菌对虫体的侵染。研究表明3个BtβGRPs蛋白可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生防的新靶标。     

应用纳米磁珠实时荧光定量PCR方法检测番茄黄化曲叶病毒

In order to develop a rapid, sensitive and specific qPCR assay for detection and quantification of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), a pair of primers and TaqMan probe were designed according to the conserved sequence of known TYLCV isolates. Combining with MNP technique, a novel MNP-qPCR detection method was established and verified based on specificity, sensitivity and reproducibility tests. The results indicated that the Ct value of plotted standard curve showed good linear relationship(R² =0.9994)with the log of copy number of template. The established method showed a high specificity for TYLCV detection without crossing reaction with Tomato severe leaf curl virus and Tomato yellow leaf curl Sadinia virus, and was 10-fold more sensitive than routine PCR. Both coefficients of variation were less than 2%, indicating a good reproducibility. We have provided a novel method for detection of TYLCV in plant samples rapidly and quantitatively.     

土壤因子对海洋多粘类芽胞杆菌L_1-9在黄瓜根表土壤定殖的影响

本试验考察了土壤温度、有机质含量和pH对海洋生防细菌多粘类芽胞杆菌L_1-9在黄瓜根表土壤中定殖的影响。采用实时荧光定量PCR方法检测了不同时期黄瓜根表土壤中菌株L_1-9的16S r DNA拷贝数。结果表明,土壤有机质含量、土壤温度和pH对菌株L_1-9在黄瓜根表的定殖有显著影响(P0.01)。25℃定殖数量最高,为5.79×108拷贝/g土,是15℃时的3.4倍;添加有机肥20~40 g/kg土壤,可以促进菌株L_1-9在黄瓜根际定殖;pH 7时,菌株L_1-9在黄瓜根表土壤中的定殖数量最高。本研究为海洋生防菌L_1-9防治黄瓜土传病害提供了理论依据。     

利用实时荧光定量PCR 技术检测油菜菌核病菌

 采用高通量实时荧光定量PCR 技术建立检测和监测油菜菌核病菌群体数量的方法。利用油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的茁-微管蛋白基因内含子序列的特异性,设计引物对SclSF (5'-CTCAAATCTCCGAAAGTT -3') / SclAF (5'-TGCAGACGGGTAATATG -3'),建立和优化了SYBR Green 玉实时荧光定量PCR 检测体系。结果表明,该引物对能够从8种所测试的十字花科植物常见病原真菌中特异性扩增出油菜菌核病菌;所建立的实时定量PCR 技术可应用于油菜病叶和病茎中菌核病菌的早期检测及菌核病的预测预报。     

龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析

为了解龙眼miR166初级体基因Pri-miR166 S53结构特点及其前体和成熟体在龙眼体胚发生早期的表达模式,采用SMART~(TM) RACE试剂盒和PCR扩增技术克隆龙眼体胚早期miR166基因的初级体(Pri-miR166 S53),确认其转录起始位点,并预测其含有的潜在ORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件;用实时荧光定量PCR对龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的胚性愈伤组织中miR166基因的前体(Pre-miR166 S53)和成熟体(miR166a.2)表达模式进行分析。结果表明:获得长317 bp的Pri-miR166 S53基因初级体序列,对其进行翻译,得到一条长13个氨基酸序列的miPEP(MLCFVDALFLIST)。利用生物信息学软件分析Pri-miR166 S53基因的启动子序列发现,除了具有TATA/CAAT-box外,还含有生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯及spl、HSE等特异作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,Pri-miR166 S53基因的前体pre-miR166 S53和成熟体miR166a.2都表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166 S53和miR166a.2表达模式不同。此外,pre-miR166S53随ABA和乙烯处理浓度升高呈下调表达,而对不同浓度2,4-D处理无应答;miR166a.2随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。     

单管实时荧光RT PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒

 本研究建立了大豆种子中菜豆荚斑驳病毒（BPMV）和烟草环斑病毒（TRSV）单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受两种病毒侵染的大豆种子作为待测样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性更强,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。