phaG基因转化马铃薯的初步研究

phaG是生产可降解塑料PHAS的关键合成酶基因,利用来源于Burkholderia caryophylli的phaG基因BcphaG,构建了其植物表达载体pTiBHS-2,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化生产上常用的马铃薯(Solanumtuberosum)优良品种大西洋,共得到9株转基因马铃薯。经PCR检测证明外源基因已经整合到植物的基因组上,West-ern blot检测表明BcphaG基因在转基因植物体内已表达。转基因植株在再生初期,苗生长慢,根的再生也很慢,但在生根后生长情况逐渐恢复正常,说明BcphaG基因对再生转基因植株的早期生长有负面影响。     

活性污泥中PHAMCL合成菌的筛选及特性研究

以葡萄糖等廉价底物为碳源合成中长链聚羟基脂肪酸酯主要取决于代谢途径和酶,近来的研究表明phaG编码的3-羟基酯酰-酰基载体蛋白-辅酶A转移酶,是连接脂肪酸从头合成途径和中长链聚羟基脂肪酸酯(PHAMCL)合成的关键酶。采用PCR的方法对食油假单胞菌的phaG基因进行扩增,进而制成地高辛标记探针,以菌落原位杂交和尼罗兰平板筛选法从A/O污水处理工艺不同阶段的活性污泥中筛选获得PHAMCL合成菌,并对目的菌株的产物合成特性进行研究。结果表明,筛选得到的3株细菌经菌体形态特征及生理生化试验,初步鉴定都属于假单胞菌属,进一步研究表明产物含量最高的菌株M26不需要限制营养成分的诱导,能以葡萄糖为碳源在细胞生长的同时合成PHA,分批发酵46h后,产物浓度达3.27g·L-1,占细胞干重的31.37%,1H核磁共振图谱分析证明产物为PHAMCL。     

phaG和phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。羟酰-CoA-ACP-转移酶和II型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的两个关键酶。将编码羟酰-CoA-ACP-转移酶的基因phaG与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子连接构建表达盒RpsbA-pro-phaG-RpsbA-ter,将II型PHA合酶的基因phaC与水稻叶绿体16S rRNA基因的强启动子Prrn及rbcL基因的终止子连接构建表达盒prrn-phaC-RrbcL-ter,连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD之间,得到烟草叶绿体表达载体pTGC。用包裹有质粒pTGC的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片,经壮观霉素筛选后获得6株叶绿体型转基因植株。对T₀代和T₁代转基因植株进行PCR检测和Southern blot分析表明,外源基因已整合进烟草叶绿体基因组中,且T₁代转基因植株已同质化。RT-PCR分析结果证实外源基因已在转录水平上表达。转基因植株的自交及正反交结果表明,外源基因在转基因后代中能够稳定遗传,遗传方式遵循母性遗传规律,不存在转基因的花粉漂移现象。