pGH和IGF-Ⅰ双基因共表达载体的构建及转双基因猪的获得与检测

旨在构建可高效表达pGH基因和IGF-Ⅰ基因的双基因共表达载体,制备转双基因(pGH+IGF-Ⅰ)猪,以期探索pGH基因和IGF-Ⅰ基因对猪生长发育的影响,为节粮型高瘦肉率新品种猪的培育奠定理论基础。从长白猪耳样中提取总RNA,经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-Ⅰ基因完整的编码序列,经酶切连接克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体上,构建pc DNA3.1(+)-pGH-IGF-Ⅰ双基因共表达载体。将其转染PK15细胞,Q-PCR检测2个目的基因在PK15细胞中的表达情况。将构建的双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子,采用精子载体法制备转双基因猪。PCR及测序鉴定转双基因阳性个体,Q-PCR检测2个目的基因在转双基因猪体内的表达情况。PCR及测序鉴定追踪检测转双基因猪体内pGH基因和IGF-Ⅰ基因的稳定情况。RT-PCR及测序结果表明,成功克隆了长白猪的pGH基因和IGF-Ⅰ基因的编码序列。酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体,转染PK15细胞后,Q-PCR检测表明,pGH基因和IGF-Ⅰ基因均在mRNA水平成功表达。母猪妊娠获得13头仔猪,经PCR及测序检测,其中4头仔猪为转双基因阳性,转双基因阳性率为30.76%。Q-PCR检测外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因在转双基因猪体内成功表达。1~7月龄均可检测到外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因,证明2个外源基因在转双基因猪体内稳定存在,并未随着生长而丢失。在转双基因公猪的精液中均能检测到2个外源基因,证明外源基因存在稳定传代的可能。     

猪生长激素ELISA检测体系的建立

本文分别以自制猪生长激素单克隆抗体及兔抗猪生长激素IgG就影响检测elisa(酶联免疫吸附法)体系因素进行探讨,建立了检测猪生长激素的elisa方法。猪生长激素单克隆抗体的最适操作参考值为：单抗最佳包被浓度为3μg/mL,包被条件为4℃过夜,5%羊血清封闭1h,兔抗猪生长激素IgG 最佳工作浓度为2μg/mL。     

3个品种猪生长激素基因的多态性分析

采用PCR-RFLPs技术,对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～＋715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaⅠ、DraⅠ、MspⅠ 3种限制性内切酶检测酶切位点的多态性.结果显示：ApaⅠ酶切时,3个品种的猪都产生了3种基因型（AA、BB和AB）,BB基因型的频率以大约克夏猪最高,AB基因型的频率以香猪最高,3个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著（P＞0.05）;Dra Ⅰ酶切时,各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;Msp Ⅰ酶切时,仅大约克夏猪表现出2种基因型（CC、CD）,香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性.结论：AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基因型;在香猪和上海白猪中DraⅠ和Msp Ⅰ酶切位点的多态性比较贫乏.     

11个猪品种生长激素(pGH)基因多态性及其遗传分化研究

利用PCR和测序技术,检测了11个猪品种共65个个体的生长激素(pGH)基因全序列多态性,发现43个SNPs和1个位于内含子3的7 bp缺失片段。分析结果表明,pGH基因DNA序列不同功能区变异程度各不相同,外显子区、内含子区、5′和3′端非编码区SNPs位点各占SNPs位点总数的18.60%、74.42%、6.98%;外显子区8个SNPs位点导致4个氨基酸位点变异,外显子2是编码区的高变域;各SNPs的变异属典型的中性突变;不同品种有其独特的单倍型。分子方差分析(AMOVA)结果表明,pGH基因DNA序列品种内的变异(方差比率73.45%)大于品种间的变异(方差比率26.55%),品种间差异极显著(P<0.01),存在较明显的遗传分化;pGH基因自身进化及品种进化主要体现在内含子区,品种间的遗传分化与地理分布和基因交流有关。     

实时荧光定量PCR技术在转基因猪生长激素基因差异表达中的应用

为确定猪生长激素基因(pGH)在F1代转基因猪体内的遗传稳定性及其在育肥初期表达水平的差异,利用SYBRGreenⅠReal-time PCR法检测精子介导纳米基因载体法获得的F0代母猪与非转基因公猪配种所产的7头转pGH基因猪和9头非转基因猪3月龄生长激素的表达水平。根据16个血液样品荧光定量结果绘制溶解曲线和扩增曲线图谱,并用F=(1+E)﹣ΔΔCt,公式进行Ct均值的分析,得出F1代转pGH基因猪生长激素平均表达水平是同期非转基因猪的1.77倍。结果证实,1)外源pGH基因在转基因猪体内能稳定传代;2)并非每头转基因猪体内pGH基因的表达量均高于非转基因猪;3)在F1代转基因猪体内,pGH的平均表达水平显著高于同期非转基因猪。本实验建立了能够稳定测评家猪生长激素相对基因表达水平的方法,为研究转基因与非转基因动物之间生理指标与定量表达的差异性等提供了科学依据。     

含第一内含子猪生长激素cDNA基因在COS7细胞中的表达

以CMV真核生物启动子构建了含第一内含子猪生长激素（pGH）cDNA基因（pGHcDNA-in）的表达载体，经DEAE-葡聚糖介导在COS7细胞进行了瞬时表达，通过PP95生物学测定法测定，证明含第一内含子pGHcDNA基因能够在真核细胞中进行分泌性表达，表达出的pGH具有生物学活性。这说明通过该基因转录出的前体mRNA能够在COS7细胞中进行正确剪接，从而翻译出具有生物活性的pGH。加入第一内含子在一定程度上可提高pGHcDNA基因的表达效率。     

湖北白猪导入OMT／PGH基因的整合,表达和遗传

以湖北白猪为实验材料,显微注射OMT/PGH基因(绵羊启动子和猪生长激素的融合基因)于1125枚1～4细胞期的早期胚胎核内,共产仔167头,产仔率14.8%。Dot(斑点杂交)和Southern blot(印迹转膜杂交)检测,29头阳性,阳性率17.9%。通过传代进行转基因的遗传分析。G_0×G_0的配种组合,产仔63头,其中阳性20头,阳性率31.7%;G_0×非转基因猪的组合,产仔66头,其中阳性10头,阳性率15.2%。对11头G_0猪血清用放射免疫法测定的结果,其生长激素的浓度相当于对照组的2.03～6.70倍。16头G_0猪180日龄的生长速度比同窝对照提高11.8%;11头G_1猪比同窝对照提高14.8%,饲料转化率提高10%,瘦肉率有提高的趋势。     

转外源基因(pGH)在猪染色体上整合状况

应用地高辛标记技术,对通过睾丸注射法制备的转基因猪进行荧光原位杂交,确定外源pGH(猪生长激素)基因在染色体上的整合位点及数目.选用睾丸注射法制备的140日龄转基因长白猪6头与同期同龄非转基因猪2头进行血细胞培养及荧光原位杂交.结果显示,外源基因已整合于染色体上,但在染色体上的整合位点具有随机性,而且不同的转基因猪阳性个体外源基因在染色体上的整合位点有差异,但集中分布于1、6、8、13号染色体上;非转基因猪染色体上无杂交信号;个体杂交信号数越多,其生长速度越快.     

藏猪生长激素基因(pGH)多态性研究

猪生长激素基因(pGH)是猪生长发育性状重要的候选基因之一。采用PCR-RFLP技术检测藏猪pGH基因+159~+734 bp片段的DraI、ApaI和MspI酶切多态性。结果显示,藏猪群体中DraI酶切全部切开,无多态;ApaI酶切具有4个等位基因,出现5种基因型,其中CC基因型(299A/432C)频率最高,为0.7857;藏猪群体MspI酶切出现3种基因型,杂合性CT基因型频率最高,为0.5089,等位基因C和T频率分别为0.5580和0.4420。经比较,藏猪pGH基因DraI酶切位点与其他猪种一样无多态性,而ApaI酶切出现了特异的432突变位点,MspI酶切等位基因分布相对均衡,表现出与其他猪种的差异。     

不同品种猪生长激素基因的PCR-RFLPs分析

采用PCR-RFLPs技术,对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～＋715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaI、DraI、MspI三种限制性内切酶检测酶切位点的多态性。结果显示：ApaI酶切时．三个品种的猪都产生了3种基因型（AA、BB和AB）,BB基因型的频率以大约克夏猪最高．AB基因型的频率以香猪最高．三个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著（P〉0．05）;DraI酶切时．各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;MspI酶切时,仅大约克夏猪表现出2种基因型（CC、CD）,香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性。结论：AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基因型;在香猪和上海白猪中DraI和Mspl酶切位点的多态性比较贫乏。