草坪草高羊茅高温诱导抑制差减杂交文库的构建及其表达

为了深入研究草坪草对抗高温逆境的分子遗传机制,构建高羊茅在高温胁迫下相关的基因文库。研究以冷季型草坪草高羊茅为研究对象,在长期生理试验的基础上,通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库,挑选部分阳性克隆进行测序,并对所获得的差异基因序列进行分析,研究了在38℃/30℃(昼/夜)培养箱中进行高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明:试验得到的差减文库中大量组成型表达的基因已经被有效去除,使某些特有的差异基因得到了富集;两个文库的基因片段的长度分布在200~900 bp,平均片段长度约500 bp左右;在构建的高羊茅耐热cDNA文库中随机挑选了123个大小约500 bp左右的EST测序,共得到100个有效序列,其中38个是未知序列,其余62个为已报道序列,但是序列功能全部未知,这些EST中有25个与叶绿体染色体有关,其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。本试验最终得到了合格的差减文库并对部分基因进行了测序,可为高羊茅耐热基因的研究提供依据,同时也为提高草坪草水肥调控措施提供了理论基础。     

锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA克隆、序列分析及原核表达

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS）是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶,获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因（FPPS）是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础。论文旨在克隆锯角豆芫菁（Epicauta gorhami Marseul）FPPS,预测该基因及其编码蛋白的结构、性质与功能,并实现其编码蛋白的原核表达。【方法】首先根据已知昆虫FPPS编码蛋白的保守区序列,利用CODEHOP软件设计简并引物,利用RT-PCR获得锯角豆芫菁的cDNA模板,巢式PCR扩增锯角豆芫菁FPPS保守区;随后根据所得的保守区片段设计特异性引物,运用RACE技术分别克隆锯角豆芫菁FPPS 3′和5′端序列;然后根据预测的FPPS开放阅读框（ORF）设计ORF区特异性引物,巢式PCR扩增编码区序列;最后用DNAMAN拼接获得锯角豆芫菁的全长cDNA序列。运用DNAMAN、MEGA 5.05、ProtParam及TargetP 1.1 Server等多种生物信息学软件对该基因全长cDNA序列、Fps系统进化关系及其基本理化性质、FPPS蛋白的亚细胞定位等进行分析;将锯角豆芫菁FPPS与pET28a（+）连接,构建原核表达载体pET28a（+）-EgFPPS并将其转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中,IPTG诱导融合蛋白的原核表达。分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段收集的菌液超声波破碎后,分离上清及沉淀并进行煮沸处理,SDS-PAGE检测融合蛋白的可溶性;Western Blot印迹杂交验证目的蛋白的表达。【结果】获得锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全长cDNA序列,命名为EgFPPS （GenBank登录号KC840040）,序列分析结果表明,该基因全长1 857 bp,其中5′非编码区146 bp,3′非编码区436 bp,开放阅读框1 275 bp,共编码424个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为49.2 kD,理论等电点pI为8.89,预测分子式为C2192H3457N605O632S25,不稳定系数为38.62,总平均亲水系数为-0.429,为疏水的稳定蛋白。序列分析发现,锯角豆芫菁与其他6种昆虫FPPS在氨基酸水平上具有72.56%的同源性,且其近N端具有R**S四肽基序,此外还包含7个异戊烯基转移酶保守区和两个典型的DD**D的天冬氨酸富含区。系统发育树显示锯角豆芫菁与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗进化关系最近。EgFPPS的亚细胞定位进行预测发现其N端具有一段明显的线粒体靶向肽。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1 mmol•L-1的IPTG诱导4 h即能实现融合蛋白的高效表达;融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌DE3中表达了一个分子量约为49 kD的蛋白质,与预测分子量大小基本一致。【结论】成功从芫菁科昆虫克隆得到FPPS,并成功实现了其编码蛋白的原核表达,为后期探索其在芫菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径中的功能提供理论基础。     

烟草钾转运体基因TPK1的电子克隆及生物信息学分析

[目的]克隆烟草钾吸收转运基因,分析其亲缘关系,并预测其结构、性质与功能,为烟草钾转运体基因的功能研究提供基础.[方法]以利用RACE技术克隆出的烟草钾转运体基因片段的3'端序列为探针,对烟草EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在95%以上的EST序列,再利用DNAStar软件进行拼接.然后,应用多种生物信息学数据库...     

毛竹AUX1/LAX候选基因家族鉴定与表达分析

AUX1/LAX家族是一类生长素输入载体，在植物生长发育和形态建成过程中起着重要的调控作用。利用同源比对的方法从毛竹基因组中鉴定出8个PheAUX1/LAX候选基因，进行系统进化树、基因结构、基序分析。结果表明，PheAUX1/LAX候选基因分为Class Ⅰ和Class Ⅱ 2个亚组，其中classⅠ的候选基因包含6~7个外显子，而ClassⅡ的候选基因包含8~10个外显子。不同组织器官转录组数据分析表明多数Class Ⅰ候选成员在毛竹冬笋中高丰度表达，而Class Ⅱ中的PH02Gene38722.t在跳鞭中高丰度表达。通过qRT-PCR对AUX1/LAX候选基因在不同生长发育时期笋中的表达量分析表明，有6个候选基因与对照相比呈现出不同程度的上调表达，表明PheAUX1/LAX候选基因广泛参与毛竹笋的生长发育。本研究将为进一步研究毛竹AUX1/LAX基因的功能和调控机制奠定理论基础。