刺糖多孢菌高产菌株和野生型菌株多杀菌素生物合成基因簇(spn)在发酵过程中的表达分析

多杀菌素(spinosad)作为一种高效、低毒生物杀虫剂,已在农药、兽药、卫生用药等领域得到应用。中国关于多杀菌素的研究起步较晚,进展缓慢,目前仍无法实现产业化生产。本研究旨在分析刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高产菌株ASAGF73与野生型菌株ATCC49460在发酵过程中多杀菌素合成基因簇(spinosyn biosynthetic gene cluster,spn)的表达变化及差异,初步判断影响多杀菌素合成的关键限速步骤。生物信息学分析表明,spn基因簇含有9个转录子,分别在各转录子中设计引物,进行RTPCR检测其表达情况。结果显示,突变株ASAGF73中多杀菌素的产量提高可能与spn基因簇中部分基因的高表达有关,其中编码聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)的基因和参与大环内联桥形成的基因表达量远高于野生型菌株的。在ASAGF73中编码鼠李糖转移酶的spn G基因在发酵前期过量表达,而在后期大量合成多杀菌素时表达减弱,有可能成为多杀菌素合成的限速步骤。本研究初步阐明能够提高多杀菌素产量的分子机制,为构建多杀菌素高产基因工程菌提供参考。     

多杀菌素发酵培养基的研究

【目的】以刺糖多孢菌C4-10-8B为试验菌株,对多杀菌素发酵培养基进行优化,以提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量。【方法】采用单因素和多因素试验,分别考察了不同碳源、氮源、前体、无机盐和微量元素对多杀菌素生物合成的影响,最后通过正交试验综合考察发酵培养基中各组分对多杀菌素产量的影响。【结果】葡萄糖是较优碳源,最佳质量浓度为40.0 g/L,当葡萄糖与糊精(质量比5∶2)复配时,多杀菌素产量较对照培养基提高18.35%;棉籽蛋白为最优氮源,25.0 g/L棉籽蛋白与15.0 g/L玉米蛋白胨或0.6 g/L硫酸铵复配时,多杀菌素产量分别较对照提高40.0%和45.3%;乙酸钠和谷氨酰胺质量浓度为1.0 g/L时,均能使多杀菌素产量较对照提高21.5%;K2HPO4对多杀菌素合成有明显的促进作用,在其质量浓度为2.5 g/L时,多杀菌素产量较对照提高24.5%;ZnCl2对多杀菌素合成也有促进作用,而MgSO4和CoCl2则显著抑制多杀菌素合成;通过2次正交试验获得最优发酵培养基,利用该培养基时多杀菌素产量可达395.54μg/mL,比对照提高了62.5%。【结论】多杀菌素生物合成的最优发酵培养基为:葡萄糖50.0 g/L,棉籽蛋白25.0 g/L,玉米蛋白胨20.0 g/L,(NH4)2SO40.8 g/L,谷氨酰胺1.25 g/L,乙酸钠0.8 g/L,NaCl 3.0 g/L,K2HPO42.5 g/L,FeSO450.0 mg/L,ZnCl225.0 mg/L,CaCO31.0 g/L。     

Contribution of contact toxicity and wheat condition to mortality of stored-product insects exposed to spinosad

Spinosad, a reduced-risk commercial insecticide derived from a bacterial fermentation product, possesses both contact and oral toxicities against insects. Contact toxicity of spinosad to adults of Rhyzopertha dominica (F), Sitophilus oryzae (L), and Tribolium castaneum (Herbst) was evaluated by exposure for 24 or 48 h to treated glass Petri dishes. Adults were exposed to different deposits (0.001-0.79 mg cm(-2)) of spinosad in 24-h tests and to deposits of 0, 0.0016 and 0.016mg cm(-2) in 48-h tests. Rhyzopertha dominica was most susceptible to spinosad in 24- and 48-h tests, followed by S. oryzae, and T. castaneum. The 24-h LD50 values were 0.0004, 0.077 and 0.189mg cm(-2) for R. dominica, S. oryzae, and T. castaneum, respectively. All R. dominica adults were dead following 48 h exposure to both spinosad deposits, whereas mortality of S. oryzae and T. castaneum ranged from 10 to 85% and 12 to 48%, respectively. Rhyzopertha dominica, T. castaneum, and O. surinamensis adults were exposed for 14 days to whole wheat, cracked wheat and wheat flour treated with 0, 0.1 and 1.0 mg kg(-1) of spinosad. Rhyzopertha dominica adults were highly susceptible to spinosad, followed by O. surinamensis and T. castaneum. Immatures (eggs and larvae) of T. castaneum and O. surinamensis exposed for 14 days were more susceptible on spinosad-treated whole wheat than on treated cracked wheat and wheat flour. This is the first report documenting contact activity of spinosad, and the effect of grain condition on spinosad toxicity, to stored-product insects.     

红色糖多孢菌GlnR转录调控因子在氮代谢中的功能研究

红色糖多孢菌是一种工业上规模化生产红霉素的放线菌。针对氮代谢中的重要转录调控因子GlnR展开相关功能研究,了解其作用机制。通过大肠杆菌克隆表达系统体外表达得到了GlnR蛋白,并用ESMA试验分析验证GlnR对amt-glnB和glnA1具有调控作用。这为探索红色糖多孢菌氮代谢调控机制和红霉素合成调控机制提供了一个新的突破点。     

辐照对糖多孢红霉菌M的诱变效应

采用不同剂量的60Co γ射线辐照糖多孢红霉菌M孢子,并采用不同的菌种保护剂,以研究60Coγ射线对糖多孢红霉菌M的诱变效应。结果表明,使用20%甘油吐温保护效果较好,可作为诱变保护剂;当辐照剂量为400 Gy时,致死率为90%左右可作为适宜诱变剂量。诱变处理后利用链霉素抗性突变选育得1203株链霉素抗性突变株。其中5株形态发生较明显的变化,形态变异率为4.16‰;2株突变株的发酵液具有抑菌活性,正突变率为1.67‰。     

96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的研究

考察了刺糖多孢菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,建立了96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的方法。结果表明：96孔板三明治盖能同时满足过滤杂菌和刺糖多孢菌生长耗氧所需,刺糖多孢菌在96孔板固体培养基中的生长情况与传统斜面培养相当,种子培养最适种龄为60 h,每孔发酵培养基装液量为0.4 mL。与传统摇瓶发酵筛选平台相比,该方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。     

多杀菌素产生菌株航天育种效果研究

[目的]探索多杀菌素诱变育种的有效途径。[方法]对多杀菌素经"实践八号"育种卫星搭载后的菌株进行稀释涂布分离并对分离后的菌株进行筛选和发酵测定,计算多杀菌素总效价。[结果]搭载后的刺糖多孢菌SP1,经大量筛选得到2株高产且遗传性状相对稳定的菌株HY463和HY466,多杀菌素总效价分别达到147.51μg/ml和95.33μg/ml,产量分别比出发菌株SP1提高288%和151%。对搭载后的菌株进行稀释涂布分离发现,菌落形态各异,有草帽状、中间凹状、放射线状和宝塔状,并且以草帽状的菌落居多,且不同形态的突变菌株发酵水平也参差不齐。[结论]与UV6、0Co等其他诱变方法相比,空间搭载诱变更能使刺糖多孢菌的产素能力得到较大的提高,是选育多杀菌素高产菌株的有效方法。     

红霉素发酵培养基的优化研究

[目的]对红色糖多孢菌产红霉素的发酵培养基进行优化。[方法]采用Design-Expert 7.0软件对发酵培养基的黄豆饼粉、淀粉、糊精和葡萄糖4个组分进行优化,再对硫酸铵、碳酸钙、玉米浆和磷酸二氢钾4个组分进行正交试验优化。[结果]最佳培养基配方为黄豆饼粉2.89%、淀粉3.025%、糊精2.04%、葡萄糖1.97%、碳酸钙0.7%、硫酸铵0.1%、玉米浆1.2%、磷酸二氢钾0.04%,优化后发酵产物中红霉素生物效价比优化前提高22.55%。[结论]得到了红霉素培养基的优化配方,使红霉素的发酵水平得到较大提高。     

多杀菌素高产菌株的选育及其分析方法的研究进展

多杀菌素(spinosad)是一种新型的天然大环内酯类抗生素,兼具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性,具有独特的作用模式,对害虫高效、对环境安全、对哺乳动物低毒,是一种应用前景广阔的新型生物农药.但经过多年的研究,在我国仍无法实现产业化生产.本文结合了近10年来对多杀菌素的研究现状,从菌株的诱变育种、发酵工艺与生物合成的优化3个方面,综述了多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌(Saccharopolyora spinosa)的选育,总结了发酵获得的天然产物的分离纯化方法以及分析检测技术在近年来国内外的研究进展,并从培养条件、诱变技术、生物试剂及其分析分离技术4个方面对国内外的研究现状进行了分析,同时对今后的研究和探索进行了展望.     

利用离子注入技术选育多杀菌素高产菌株

多杀菌素是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的大环内酯类化合物,是一种应用前景广阔的生物农药。采用氮离子注入方法并结合前体和自身代谢物抗性来选育多杀菌素高产菌株。结果显示利用氮离子注入诱变刺糖多孢菌,其致死率曲线呈典型的马鞍形,并确定30 s×2.6×1013 ions/cm2的注入剂量用于进一步诱变筛选。通过前体及自身代谢物抗性筛选,最终得到5株多杀菌素高产菌株,其多杀菌素的最高产量比选育前提高了44%。表明该技术对多杀菌素高产菌株的选育是一种行之有效的方法。