正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

RAPD技术对地方鸡种群体遗传结构的分析

利用ＲＡＰＤ技术对４个地方鸡种和１个引进鸡种的群体遗传结构进行分析，通过筛选的５个随机引物ＯＰＨ－０２、ＯＰＨ－０５、ＯＰＨ－１３、ＯＰＨ－１６、ＯＰＧ－０７对５个鸡种的池ＤＮＡ进行多态性研究，结果表明：５个引物共产生条带６１个，扩增产物片段的长度一般从１５０ｂｐ－４ｋｂ。     

不同引物对植原体的检测灵敏度比较研究

用常规PCR和巢式PCR对目前常用的各种植原体引物(fPl/rP7、fU5/rP7、fU5／rU3、fAY/rEY和fFD9/rFD9)的检测灵敏度进行了比较研究。研究发现，它们的检测灵敏度并不相同。最灵敏的引物(fAY/rEY)要比最不灵敏的引物(fFD9/rFD9)的灵敏度至少高出数千倍。因此，按照不同的检测目的选择所用的检测引物是明智的，特别是当待测样品中的植原体浓度极低时，比如葡萄组织样品中植原体的检测。据此提出了用于不同检测目的时的最佳引物。     

毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因在大肠杆菌的表达

根据克隆的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因(EnMIC-2(Gd))的cDNA序列设计特异性引物，用PCR方法扩增其阅读框架(ORF)后，克隆至质粒表达载体pET-32a( )，成功构建了重组表达质粒pET-32a( )-EnMIC-2。用CaCl2法将其转化至宿主细菌E.cliBL21(DE3)，并用IPTG成功诱导了EnMIC-2重组抗原在大肠杆菌表达。表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的10．8％，其相对分子质量约为55000。重组蛋白经SDS-AGE分析后，用E．necatrix(广东株)感染鸡的高免血清进行Western Blotting分析，结果为阳性。     

紫花苜蓿细胞质雄性不育恢复基因的初步定位

以紫花苜蓿(Medicago sativa)不育系MS-GN-1A为母本,恢复系MS178为父本组合构建BSA分离群体,获得的F1代均表现为雄性可育,在大田种植了221株F2代群体单株,盛花期将花粉颗粒染色后,显微镜下观察统计出,不育的F2代株数为57,可育F2代株数164,并没有观察到半不育植株。将所有植株划分为可育和不育两组,并构建可育和不育DNA混池,混池DNA从可育和不育植株组DNA中各随机抽取20个样品,以此对恢复基因定位。随机挑选160对已知的四倍体苜蓿SSR引物扩增基因池DNA,获得2个具有多态性的分子标记,分别是Mt2c12、AW166,初步定位Rf基因在类群Composite5上。将类群Composite5上的所有引物进行合成,进一步进行引物筛选,最终获得4个具有多态性的标记BI68、Mt2c12、BG267和AW776153,遗传距离分别为19.0、20.9、44.6和72.1cM。     

牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立特异性强、灵敏度高、重复性好的产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，本试验根据产气荚膜梭菌的plc基因保守序列设计合成特异性引物探针，摸索其最佳反应条件，进行灵敏性、特异性、重复性以及临床样本验证。结果表明：建立的方法具有较好的灵敏性、特异性及重复性，最低检出限度为8.26×10¹拷贝/μL，在8.26×10³～8.26×10⁸拷贝/μL的范围内具有良好的线性关系，同时不与其他致病菌发生交叉反应，组间及组内的变异系数均小于4%，应用比方法在采集的300份临床样品中检出24份阳性样品，与常规细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。说明试验成功建立了牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，这将为牛产气荚膜梭菌的快速诊断提供技术支持。     

长链寡核苷酸生物合成方法的研究

化学合成长链寡核苷酸面临许多困难，研究通过对长链寡核苷酸生物合成方法的研究，成功合成并纯化了长链寡核苷酸，其长度达到146nt，并且其序列没有错误。生物合成的基本方法是：首先用一对PCR引物扩增DNA模板，     

大麻ISSR引物的筛选与细胞学制片技术的优化

在稳定的ISSR-PCR扩增条件下,使用50个大麻ISSR引物对代表性的大麻材料进行PCR扩增,筛选出14个适合大麻的ISSR引物;同时,为优化大麻染色体的制片质量,对大麻染色体制片过程中的变温预处理、低温提高中期分裂相的方法及解离等具体技术与方法进行了试验,优化后的大麻染色体制片条件为:芽长达1 cm后(21℃),23℃条件下促芽生长24 h,再低温(0℃)处理24 h,37℃解离20 min(20 g/L纤维素酶和20 g/L果胶酶)。适合大麻ISSR-PCR反应的引物筛选与染色体制片技术的优化,将为大麻遗传多样性的多层次化分析提供试验基础。     

基于介观量子理论的最佳PCR引物浓度计算

对PCR反应体系而言,引物浓度过高或过低对反应体系都存在严重的影响,只有合理的浓度区间才能对整个反应高效有序地进行发挥重要的作用.降低PCR引物间的量子效应有利于提高引物间PCR反应的独立性和确定性,故粒子自由程至少是相位关联长度的10倍,并由此可以得到引物反应浓度的上限;粒子非弹性散射的最大自由程是粒子运动的极限自由程,依此可以得到引物反应浓度的下限,从而确定了引物的有效浓度区间;引物浓度-扩增效率曲线一般呈单峰分布,利用黄金分割法可以精准、迅速地确定引物最佳浓度。基于上述计算方法,长20、25、30 nt的引物有效浓度区间分别为0.027~5.280、0.019~7.310、0.015~9.461 umol·L-1。引物有效浓度区间及最佳浓度对PCR反应体系的反应效率与速率、PCR产物质量等具有决定性的作用,而应用理论方法确定它们将对理论指导实验具有重要的意义。