花生抗黄曲霉相关基因PnLOX2的原核表达及RNAi载体的构建与转化

本研究对利用基因芯片技术从抗、感黄曲霉花生品种中分离出的差异表达基因PnLOX2进行原核表达,得到分子量为121.5 kD的融合表达产物;构建了PnLOX2基因的3'端反向重复结构并转化花生,得到了转基因花生苗,为反向鉴定PnLOX2基因在花生抗黄曲霉侵染过程中的功能奠定基础。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

苦荞查尔酮合成酶多克隆抗体制备及组织表达分析

苦荞查尔酮合成酶(FtCHS)是黄酮类化合物合成过程中的限速酶之一,在苦荞黄酮类次生代谢物合成中起到重要作用。以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得FtCHS基因,通过生物信息学分析确定FtCHS的截短抗原基因序列(TrCHS)。再通过原核表达、亲和层析等方法制备并纯化TrCHS抗原,以纯化的抗原免疫大白兔获得TrCHS的多克隆抗体,利用半定量RT-PCR、Western blotting方法分析苦荞不同器官FtCHS的表达情况。结果表明,成功克隆FtCHS基因开放阅读框(ORF)大小为1 182 bp,共编码393个氨基酸,通过原核表达获得TrCHS抗原的分子质量约34.71 ku,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性,FtCHS基因在苦荞叶子、种子的表达量明显最高。     

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.     

花生防御素基因的克隆及原核表达

植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

水稻OsUAP2基因生物信息学分析及原核表达活性鉴定

UAGPase广泛存在于生物体,是糖代谢过程中一类重要酶。我们前期发现水稻Os UAP1具有单向催化UDPG分解代谢活性,Os UAP2与Os UAP1序列相似性极高。本研究对Os UAP2进行生物信息学分析,构建并表达重组蛋白,并鉴定其酶蛋白活性。结果表明,OsUAP2基因位于4号染色体,编码区序列长1482 bp,编码493个氨基酸;Os UAP2具有UDPGP保守结构域,无跨膜区域,N-端不含信号肽;二级结构分析显示,该蛋白含α-螺旋和无规则卷曲较多;同源性分析表明,Os UAP2与玉米UAGPase的亲缘关系最近。在16℃下经0.1 mmol/L IPTG诱导8 h,原核菌株BL21表达出分子量约55 kD可溶性重组蛋白。体外酶活性测定表明,Os UAP2能同时催化UDPG降解和合成,表现出双向可逆催化的特点。本研究结果为进一步深入研究OsUAP2基因的生物学功能提供了科学依据。     

西农538 LMW-GS基因的克隆、原核表达及功能鉴定

为了探索普通小麦品种西农538的LMW-GS对面粉加工品质的影响,根据NCBI中已公布的LMW-GS基因序列,设计了一对特异性引物,从西农538基因组DNA中克隆出LMW-GS基因后,对其进行原核表达及掺粉试验。序列分析表明,克隆得到的LMW-GS基因序列(GenBank登录号为KX452081)有单一完整的开放阅读框,编码区长915bp,无内含子。同源性比对及进化树分析发现,该基因属于Glu-D3、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因原核表达成功。微量掺粉试验表明,诱导表达的蛋白对小麦面粉加工品质有负效应。     

猪肌肉生长抑制素基因的克隆及原核表达

本试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。根据基因库肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基,提取汉普夏猪的骨骼肌总RNA,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆到pET-30a( )中,构建原核表达载体pET-30a-M,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,诱导表达。结果表明,成功扩增出肌肉生长抑制素全长基因;克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与国外报道的完全一致;成功构建原核表达载体pET-30a-M;经IPTG诱导,表达出了6×His-M融合蛋白,用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约48 ku,与预期大小相符,肌肉生长抑制素蛋白在大肠杆菌中成功的进行了表达。     

犬瘟热病毒Lederle株H,N全基因序列分析及表达研究

采用RT-PCR方法自犬瘟热病毒Lederle株基因组RNA中扩增出H基因(1 911 bp)和N基因(1 707 bp)片段,序列测定和分析表明与Onderstepoort株、CDV3株等疫苗毒株的同源性在95%以上,而与野外分离株的同源性介于90%～95%;以获得的H,N全基因片段为模板,分别扩增H基因近3′端996 bp的基因片段以及N基因中间高度保守区562 bp的基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,结果显示H片段和N片段分别表达大小约为57 kD和37 kD的融合蛋白,Western blotting检测结果显示,表达蛋白均可与CDV抗血清发生阳性反应,提示原核表达产物具有与CDV抗血清结合的免疫反应性。