抗速灭威单链抗体基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质研究

选用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）系统表达特异性抗速灭威单链抗体（scFv）基因,以为速灭威特异性抗体的大量制备奠定基础。设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,获得重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris（X-33）,对转化子进行抗性梯度筛选得到一株高效表达的X-33-Pp-SMW-12-6菌株。对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果表明：P.pastoris-scFv的质量接近其亲本E.coli-scFv的质量,X-33-Pp-SMW12-6在优化条件下的表达产量达28mg/L,比未优化前的产量提高了约8mg/L,经纯化后抗体纯度可达85%以上。因此,利用P.pastoris表达系统制备抗速灭威单链抗体比细菌表达系统更有效、更经济。     

弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达

以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍.     

木糖还原酶基因克隆及重组表达载体的构建

木糖还原酶是木糖醇生物合成的关键酶,催化木糖合成木糖醇。以实验室筛选并经分子生物学鉴定为季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因为基础,以酵母表达载体pPICZαA成功构建了含有木糖还原酶的重组表达载体pPICZαA-xyl,为进一步研究真核表达木糖还原酶和木糖醇的生产奠定基础。     

糖化酶工业株的鉴定及糖化酶基因的克隆

对4种糖化酶工业株的rDNA片段进行克隆,在对比其rDNA-ITS1序列与GenBank数据库的基础上,结合形态学观察对菌株进行了鉴定。结果显示,4种菌株分别为黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉和灰色小克银汉霉。通过Me-gAlign得到的进化树表明,前3种菌株亲缘关系较近,三者与灰色小克银汉霉的亲缘关系较远。进一步克隆了黑曲霉、无花果曲霉和米曲霉的糖化酶基因,并在毕赤酵母中实现了分泌表达。     

黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达

将黑曲S（Aspergillus riger）NRRL3135中的植酸酶基因转入毕赤酵母GS-115中,并整合到染色体DNA上,然后进行诱导表达。通过SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,发现重组毕赤酵母GS-115分泌了1个约100kD的蛋白,分泌的蛋白较大。用脱糖基化酶endoglycosidase H降解后,形成了约50kD的蛋白,与植酸酶基因产物的理论值相符。通过对表达产物的酶学性质研究,发现该表达产物在pH2．5和pH5．5时具有较高植酸酶活性,同时该表达产物的最适温度约为55℃。这说明植酸酶得到正确的分泌表达。     

昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定

 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin (Drs)及其同系物Drosomycin-like C (Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达，对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因（Drs）及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组，构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA–Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子，在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用，Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母，并实现其分泌型表达。     

Optimization of Media for Production of an Effective Yeast Biocontrol Agent Pichia membranefaciens

The growth of Pichia membranefaciens was studied using different nitrogen and carbonsources as substrates. Among nitrogen sources tested, soya peptone, yeast extract power,beef extract and polypeptone were relatively favorable to the growth of yeast. Thedensity of the yeast showed to be directly proportional to carbon sources supplementation.Glucose and fructose were good carbon sources for the yeast growth. However, lactoseshowed poor performance for the cell growth of the yeast. In this study, beef extractpresented a good synergic effect on the yeast growth with different carbonhydrates. Themedium for P.membranefaciens used glucose and beef extract as substrates. The higherconcentration of glucose and beef extract, the better growth of P.membranefaciens. Theaddition of chlorella growth factor (CGF) stimulated markedly the growth of P.membranefaci-ens. The increased concentration of CGF from 0.5 to 1% did not enhance the numbers ofP.membranefaciens. This result will help design a better strategy for scale-up produc-tion of P.membranefaciens.     

拮抗菌与病原菌处理对采后桃果实多酚氧化酶、过氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶的诱导

 Pichiamembranefaciens能有效抑制桃果实采后软腐病。笔者观测和比较接种拮抗酵母菌P .mem branefaciens和软腐病菌Rhizopusstolonifer对采后桃果实多酚氧化酶 (PPO)、过氧化物酶 (POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的诱导情况。试验结果表明 ,桃果实接种P .membranefaciens +R .stolonifer 2 4h后 ,PPO和PAL活性开始升高 ,并在整个试验过程中一直保持较高的水平。只接种R .stolonifer也能诱导桃果实PPO和PAL活性的增加 ,但效果不如接种拮抗菌 +病原菌的好。然而 ,接种拮抗菌 +病原菌和只接种病原菌对诱导POD活性都没有明显的作用。可以认为 ,拮抗菌诱导抗性相关酶活性的提高是发挥抑病作用的一种重要方式     

斑点叉尾(鱼回)LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

LEAP-2 (Liver expressed antimicrobial peptide-2) 抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽,其生物学活性来自成熟肽区域,它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。本文以斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) LEAP-2成熟肽(mLEAP2)为研究对象,拟通过建立毕赤酵母表达系统,实现mLEAP2在毕赤酵母中的重组DNA表达,以期获得具生物学活性的重组体mLEAP2 (rmLEAP2),为进一步研究其功能和扩大制备奠定基础。首先以既有的斑点叉尾鮰mLEAP2的原核表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板,通过PCR扩增,获得5’端含EcoRⅠ酶切位点、3’端含NotⅠ酶切位点及6×his标签的LEAP-2成熟肽基因mLEAP2,然后将其与真核表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”;电转化至毕赤酵母GS115细胞中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选,获得高拷贝酵母转化子;在29 ℃、250 r/m条件下,以0.5%的甲醇对其诱导表达120 h;采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,通过MALDI-TOF/TOF质谱对纯化产物的结构进行分析和鉴定。结果表明：表达的重组体蛋白为预期的目的蛋白rmLEAP2,其表达量约2.2 mg/L;另一方面,抑菌实验结果显示rmLEAP2具有明显的抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性。     

嗜热子囊菌JCM12803来源的阿魏酸酯酶FAE-2515酶学性质研究

阿魏酸酯酶广泛应用于食品、药品、饲料及造纸等行业,挖掘适用于工业化的阿魏酸酯酶至关重要。从嗜热真菌Thermoascus crustaceus JCM12803中克隆得到一个阿魏酸酯酶基因FAE-2515,经基因序列分析,FAE-2515 cDNA全长为1 581 bp,编码526个氨基酸和1个终止子,理论分子量大小为57 kDa,等电点为5.08。将FAE-2515成功地在毕赤酵母中实现高效异源表达,通过对重组蛋白进行酶活测定,比活为（53.653±3.451）U/mg,Kcat/Km值为1.423,最适pH为6.0,最适温度为55℃,60℃处理1 h之后还能保持60%的酶活,热稳定性较已报道的同类酶更为稳定。以阿魏酸甲酯为底物时酶活表现为最高,以硝基苯棕榈酸酯为底物时几乎没有酶活。金属离子K+、Ca2+、Na+对该酶有显著的促进作用,Fe3+、Zn2+对该酶有轻微抑制作用,Mn2+、Cu2+对该酶有显著的抑制作用。综上,该酶在造纸工业和动物饲料制备工业中具有一定优势。